【項目文章】大豆冷脅迫研究文章解讀

miRNA是一類內源性小RNA,長度為18-40nt,不編碼蛋白。在植物中以降解mRNA或阻止mRNA翻譯的方式起到重要作用。大多數已知的miRNA都會參與植物的生長發育過程,已經在擬南芥、楊樹等植物中鑒定到了一類響應冷刺激的miRNA。大豆是一類重要的糧食作物,具有很高的營養成分。然而,冷脅迫會直接影響大豆的生長發育并導致產量的減少。今天小R就為大家分享一篇研究大豆冷脅迫下miRNA及其靶基因的作用機制的文章。

實驗材料

大豆“Taiwan 75”培養在正常條件下,第一真葉期的幼苗分為對照組和處理組。對照組—25°C(12h),17°C(12h),處理組—4°C(24h)。設置3次生物學重復。

研究結果

1.sRNA測序數據統計
首先,對大豆4°C處理組(3h、6h、9h、12h、24h和36h)及對照組進行相對生長速率(RGR)和MDA含量的檢測。發現在24h時,對照組和處理組RGR和MDA含量明顯不同。因此,選擇冷脅迫24h進行sRNA測序。

對照組和處理組分別獲得6559098和8273245 clean reads。長度為21nt所占比例最高(圖1A)。非冗余的reads,長度分布統計可以看出24nt所占比例最高,在對照組和處理組中分別為68.4%和59%(圖1B)。

圖1.sRNA長度分布圖

2.鑒定大豆中已知的miRNA
共鑒定到已知的434個miRNA,屬于133個家族。這些miRNA包括保守miRNA和種間特異性miRNA。保守miRNA在植物發育過程和響應脅迫上起到重要作用。通過同源比對鑒定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156,miR160,miR164等在很多植物物種中都是高度保守的。此外,找到一些非保守miRNA,例如miR3522,表明他們可能參與大豆的物種進化。

 

3.預測大豆中新的miRNA
根據miRNAs前體的發夾結構來預測miRNAs,找到3個預測的miRNA并鑒定折疊成的二級結構。

 

4.驗證大豆中預測的miRNA
為了驗證測序結果,利用qRT-PCR分析miRNA表達情況。選擇了35個miRNA(33個已知miRNA,2個預測miRNA)進行qRT-PCR分析。線性回歸分析測序結果和qRT-PCR結果相關性系數為0.8048,表明miRNA-Seq和qRT-PCR結果相一致。盡管miRNA-Seq和qRT-PCR結果在精確的倍數方面有些差異,這可能是由于2種實驗結果敏感性和特異性的不同導致的,但是miRNA表達趨勢是一致的。

圖2.qRT-PCR結果

5.miRNA靶基因鑒定
利用降解組測序鑒定miRNA降解的靶基因。共獲得12283683條raw reads,2623291條非冗余raw reads。共鑒定到898個轉錄本是54個miRNA家族的靶基因。本研究發現miRNAs可以降解2個甚至更多的靶基因,與之前的研究相似。例如,gma-miRNAs可以沉默屬于SBP家族的15個基因,脫落酸響應結合因素蛋白家族和2個基因,2個轉錄因子等。而且,有7個轉錄本受到多個miRNAs的調控。

 

6.鑒定大豆冷脅迫下相關的miRNA
對miRNA進行差異表達分析,共鑒定到32個miRNA家族的51個miRNA差異表達。在冷脅迫下有30個下調表達,21個上調表達。

對相應靶基因進行功能注釋來研究差異表達的miRNA可能行使的功能。差異表達的miRNA可以分為四類。第一類包括miRNA家族(miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327),靶基因為轉錄因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH,參與調控基因表達和信號傳導。第二類包括miR4411,其對應靶基因涉及抵御疾病。第三類包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416,其對應靶基因參與植物生長發育中的適應性。為了進一步確認冷脅迫下miRNA和靶基因的關系,選擇了5個miRNAs及其靶基因進行qRT-PCR驗證。結果表明,在冷脅迫下miRNA-164a,miRNA-4411和miRNA-169e上調。相反的,他們的靶基因NAC、DRP和NFY顯著下調。說明miRNA和對應靶基因呈負相關性。


圖3.miRNA和對應靶基因qRT-PCR圖

 

為了近一步確認這些差異表達miRNA的功能,對靶基因進行GO分析。靶基因共參與了56個分子功能terms,37個生物學過程terms和7個細胞組分terms。在分子功能分類下,ATP結合、蛋白結合、組蛋白結合等terms是顯著富集的。超過35%miRNAs的靶基因參與了生物學過程途徑。

 


圖4.GO注釋

結 論
首次研究大豆冷脅迫下miRNA調控基因表達情況。利用降解組測序鑒定到了上百個靶基因,揭示miRNAs和靶基因之前的相互關系。盡管miRNAs調控機制十分復雜,目前還不是十分清楚,本次研究完善了miRNA數據庫,為研究大豆和其他物種的基因調控網絡提供了重要基礎。也發現了51個響應冷脅迫的miRNAs。

文章亮點
1.處理時間點的選擇上進行了預實驗,設置多個時間梯度進行處理并進行生理指標測定,最終選擇變化較為明顯的時期。選樣時間點有理有據。
2.利用降解組測序準確鑒定miRNA降解的mRNA。

參考文獻
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.

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