【項目文章】斑馬魚的生物鐘通過核激素受體Nr1d1直接調控細胞自噬,通過Cebpb間接調控細胞自噬

中文名:斑馬魚的生物鐘通過核激素受體Nr1d1直接調控細胞自噬,通過Cebpb間接調控細胞自噬
英文名:The circadian clock regulates autophagy directly through the nuclear hormone receptor Nr1d1/Rev-erbα and indirectly via Cebpb/(C/ebpβ) in zebrafish
雜志:Autophagy,2016
影響因子:9.108

 

研究背景

細胞自噬是一種非常保守的細胞內降解系統,近期的研究表明小鼠中細胞自噬現象表現出了生物鐘節律,nr1d1基因缺陷能導致小鼠骨骼肌中自噬活動的紊亂。然而生物鐘調節細胞自噬的機理還不清楚。斑馬魚的細胞自噬活動是否表現出生物鐘節律還沒有報道,本研究旨在以斑馬魚為實驗材料研究nr1d1基因在調節細胞自噬的生物鐘節律方面的作用。

 

實驗設計

實驗材料:2種材料:野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚
2個時間點:CT2和CT14(分別為受精后122和134小時);
無生物學重復
測序方法:百邁客Illumina HiSeq2000 PE125

 

 

結果展示

1.表型描述及關鍵基因在幼魚和肝臟中的表達情況

首先用TEM(透射電鏡)對一天內不同時間(ZT0,ZT6,ZT12,ZT18)的肝臟切片進行觀察,統計一天內自噬體數量的變化(紅色箭頭處,圖1,A),并進行統計(圖1,B),研究表明斑馬魚肝臟內自噬體的數量符合生物鐘節律。

TEM觀測及自噬體數量統計結果

選取了幾個以前研究過的與自噬體形成、移動、延伸、融合、降解有關的基因進行RT-PCR分析,如maplc3b,bnip3,becn1等。材料為受精后72-96小時的斑馬魚幼體和肝臟材料。由圖可見這些基因都表現出明顯的生物鐘節律。圖中白色底色表示白天,灰色底色表示黑夜。

圖2 關鍵基因的RT-PCR檢測

2.用TALEN技術構建nrid1突變斑馬魚,并進行表型研究和關鍵基因表達分析

用TEM觀察WT和nr1d1突變斑馬魚肝臟中的自噬體數量,研究表明自噬體數量在nr1d1中明顯高于WT。

圖3 不同樣品斑馬魚肝臟自噬體觀測及統計

用RT-PCR研究在WT和nr1d1突變斑馬魚中關鍵基因的表達差異,nr1d1突變體中基因表達模式與WT中明顯不同。

圖4 差異基因的RT-PCR驗證

3.用ChIP和熒光素酶研究Nr1d1直接調控的下游基因

體外熒光素酶實驗表明Nr1d1蛋白能直接結合ulk1a基因的promoter區域,體內ChIP實驗進一步證明Nr1d1蛋白能夠結合ulk1a基因的promoter區域。說明Nr1d1能直接調控ulk1a基因的表達。

圖5 熒光素和chip結果

4. 野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚轉錄組分析

為了進一步說明nr1d1基因的功能,文章選取了野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚進行轉錄組研究,并且取了2個時間點(CT2和CT14)。研究表明在CT2階段兩者有975個差異表達基因,在CT14階段有1360個差異表達基因。與WT相比,在nr1d1突變體中上調的基因數量要大于下調的基因數量。

同時,選取部分關鍵的差異表達基因進行RT-PCR驗證,結果與轉錄組分析結果一致。

圖6 差異基因韋恩圖

圖7 差異基因聚類圖


圖8 關鍵基因的RT-PCR驗證

研究結論

通過研究WT野生型和nr1d1突變型斑馬魚的基因表達情況,表明Nr1d1基因在生物鐘調節和細胞自噬過程中起著重要作用。生物鐘相關基因直接受Nr1d1調控。此外,通過轉錄組分析表明Nr1d1還調控脅迫、代謝、信號傳導、翻譯后修飾等生理過程。

圖9 Nr1d1在生物鐘和細胞自噬過程中的作用模式圖

亮點

1.首次利用斑馬魚研究生物鐘和細胞自噬的關系;
2.發現Nr1d1在生物鐘調節和細胞自噬過程中的關鍵作用;
3.轉錄組研究進一步證明Nr1d1的作用,并揭示Nr1d1其它生理功能。
4.雖然轉錄組的內容在這篇文章中比重不大,但卻揭示了除了生物鐘調節和細胞自噬,Nr1d1基因還有很多其它的功能,顯著提升了文章的水平,并為后續研究打好了基礎。

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