【項目文章】轉錄組BSR揭示玉米S型細胞質雄性不育的育性不穩定機制

Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq
發表雜志:PLOS ONE
發表日期:2016-9-26
合作單位:北京農林科學院

研究背景:

細胞質雄性不育(CMS,花粉不育但雌蕊能正常發育)是高等植物中的常見現象,表現為母系遺傳。CMS廣泛應用于作物雜交育種,以避免額外的人力物力去人工去雄,因此,CMS具有重要的理論和商業價值。植物CMS是由核線粒體相互作用介導的,不育性狀的產生來自線粒體基因的表達,但不育性狀可以通過核恢復育性基因得到恢復,產生育性部分恢復的表型。目前造成育性不穩定的遺傳修飾的分子機制仍然不清楚。本研究欲通過BSR的策略尋找引起玉米育性不穩定的候選基因。

材料選取:

Jing724和 MD32(CMS-S:S型細胞質雄性不育系)為親本,雜交得到F1群體,再以Jing724為回交親本,構建BC4群體,群體大小462。選取BC4群體中極端30個完全雄性不育植株的花粉,分別提取RNA,并等量混合構建不育池S,同理選取30個育性部分恢復植株的花粉,構建育性部分恢復池F。
測序平臺:Illumina HiseqTM2500,PE125
測序數據:150M clean reads

主要結果:

1、育性分析:FIL-B(育性不穩定系)分為育性部分恢復的植株和完全不育植株,本項目所構建的BC4群體462個子代中有14.9% 的植株為育性部分恢復的表型。育性部分恢復植株的花粉大小小于正常花粉,大于完全不育植株的花粉(Fig 1.)。經I2-KI染色后的不育花粉表現出形態的不規則和染色的異常(Fig 2.)。

 

Fig 1. FIL-B花粉展示

A:Jing724 和FIL-B (育性不穩定系,包括育性部分恢復植株和完全不育植株) 在抽穗6天后的穗;B: A圖中各植株穗上的花粉. 其中紅色的標尺代表 3 cm

Fig 2. I2-KI染色后的花粉

A: 正常花粉; B: 育性部分恢復花粉;C:不育花粉

 

2、顯微鏡下觀察花粉小孢子:在育性部分恢復的植株中只有一部分的小孢子呈現在正常形態,而在不育植株中無正常形態小孢子。(Fig 3.)

Fig 3. 花粉小孢子的顯微觀察
A: 正常花粉; B: 育性部分恢復花粉;C:不育花粉

 

3、混池間差異基因分析:本項目以B73為參考基因組,將F池和S池獲得的89M和61M clean reads進行比對。F池和S池的唯一比對效率為72.79% 和69.17%,表達的基因數目分別為31,905和31,895。獲得混池間的差異基因數目3,672個,在F池中上調表達的有3548個,下調表達的有124個,這些基因共3540個通過NR, Swiss-Prot, GO, COG和 KEGG數據庫得到注釋。

4、BSR關聯分析:與參考基因組比對后,F池和S池分別獲得171,594和 170,820個 SNP,選取混池間差異的SNP位點,進行ED關聯分析,共得到5個候選區域(Fig 4.),結合數據庫注釋結果及轉錄組差異基因的結果,最終獲得12個候選基因(Table 2、Table 3)。

 

 

Fig 4. ED關聯分析結果圖
A: 各染色體上SNP的ED值; B: 2號染色體上SNP的ED值;C:各染色體上SNP經擬合后的關聯分析結果;B: 2號染色體上SNP經擬合后的的關聯分析結果,其中紅色的虛線代表閾值線(99百分位法計算得到),黑色的實線代表擬合曲線

5、關聯基因的qPCR驗證:
本研究選取6個與蛋白相關的候選基因,通過qPCR的方法驗證RNA-seq結果。研究發現在育性部分恢復和不育兩種表型中,這6個候選基因出現4-8倍不同水平的差異表達。

Fig 5. qPCR驗證結果

6、KASP驗證:
本研究選取BC4群體中50株育性部分恢復植株和50株不育植株,分別提取DNA,對候選的兩個蛋白基因共4個SNP位點進行KASP驗證,發現在不同的表型下會出現不同的基因型,再次暗示這兩個基因很可能是與育性不穩定相關。

Fig 6. KASP驗證結果

文章亮點:

1、研究性狀雄性不育在育種工作中具有重大意義,算得上熱點研究。
2、BSR定位結果準確:轉錄組BSR不僅能實現SNP水平的定位,同時能從基因的差異表達水平進一步縮小候選范圍,定位結果相對精細。
3、驗證內容豐富:從RNA水平(qPCR)和DNA水平(KASP)驗證,只為拿到候選基因。

參考文獻:

Su A, Song W, Xing J, et al. Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq[J]. PloS one, 2016, 11(9): e0163489.

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