轉錄組研究樺樹類病變突變體lmd表型之謎

雜志期刊:Scientific Reports
發表時間:2017年9月12日(online)

1.研究背景
植物類病變(lesion mimic, LM)又稱類病斑,是指在沒有受到任何病原菌侵染的條件下,植物自發產生壞死斑點。這種局部細胞的壞死屬于細胞程序化死亡(PCD),細胞程序化死亡在植物生長發育過程中廣泛存在,特別是受到生物或非生物脅迫,當受到不相容的病原菌感染時,植物可以在受感染的部位啟動某種形式的PCD,以限制病原體的傳播,這是一種先天性的免疫反應,稱為超敏反應(HR)。HR是植物細胞為限制病原菌生長而快速死亡的一種方式,其誘導的細胞死亡可以激發鄰近組織的防衛反應(defense response)和植株的系統獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)。

水稻與玉米類病變突變體表型

研究HR信號轉導最有效的方式就是利用一類表現型與病原菌侵染后HR癥狀類似的突變體開展工作,這些突變體稱為類病變突變體(lesion mimic mutation,LMM)。植物類病斑突變體根據其表型特征及PCD發生是否可控,分為起始型突變體和擴散型突變體。前者是指在無病原菌侵染下,植物體自發形成一些位置和大小相對穩定的斑點;后者是指斑點形成后易擴散,且這種類型的斑點之間沒有明顯的界限。研究發現,類病變發生的機制相當復雜,主要受抗病、調控死亡及代謝相關基因的調控。其次,活性氧途徑、水楊酸、茉莉酸、乙烯以及一氧化氮在植物抗病和超敏反應中也發揮了重要作用。

2.實驗材料
轉錄組材料為lmd、oe21、NT,lmd突變體是從BpGH3.5轉基因株系中分離出;oe21株系是正常的BpGH3.5轉基因株系;對照材料是非轉基因的NT。
測序平臺:百邁客Illumina HiSeq 2500,PE125

3.結果解讀
1、lmd突變體表型鑒定
作者在研究BpGH3.5在樺樹中的功能時偶然獲得了lmd突變體。構建的21株OE-GH3.5株系中,唯獨lmd葉片表現出壞死斑點并伴有早衰的現象。這很明顯是一種病變的表現,當這種情況出現,很顯然我們要思考兩個問題:
一、lmd獨特的表型顯然不是過量表達BpGH3.5導致的,那么引起lmd與其他20株BpGH3.5超表達株系表型差異的原因是什么?
二、是否是感染某種病原菌導致的lmd出現壞死斑點的表型。這兩個問題的連接點就在于表型,但解決的方式不一樣。
一問題解決的是lmd內部矛盾;二問題探討的是外部因素。解決好這兩個問題,也就揭開了lmd身上的神秘面紗。在解決這個問題之前,首先要明確lmd展現出的phenotype外部因素是什么?植物表現出壞死斑點,最容易聯想到病菌,但在木本植物培養基上的lmd幼苗同樣表現出了這種表型,這說明引起lmd表型的原因并不是病原菌而是一種自發的現象,作者做出判斷lmd應該是一種lesion mimic mutants(LMM,類病變突變體)。而關于lmd的內部矛盾也很好理解,超表達株系中某一株系表現出與眾不同的表型,很容易讓人想到是否是插入位點影響了某個重要功能基因。作者接下來就通過一系列實驗來求證這些觀點。

圖1:Lmd生長相對遲緩

圖2:lmd葉片

圖3:立體顯微鏡下不同葉齡的葉片病變部位

類病變突變體通常會表現出自發性的細胞程序性死亡(PCD),作者通過伊文思藍染色比較了lmd與NT、oe21的細胞死亡情況(圖4);丙二醛含量檢測間接反映了lmd細胞損壞程度也更高(圖5);

圖4:lmd葉片染色以及與NT、oe21的對比分析

圖5:MDA含量測定

2、細胞結構變化揭示lmd突變體表型
細胞程序性死亡經常伴隨著細胞結構的變化,光學顯微鏡顯示lmd突變體的死細胞聚集在一起,而周圍的細胞是正常結構的,死細胞并沒有明顯擴散痕跡(圖6),表明lmd是起始型的類病變突變體。接下來作者用透射電鏡觀察了lmd葉片細胞的超微結構。與oe21和NT相比,在lmd突變體中觀察到更多的死細胞,一些細胞產生吞噬作用,細胞器消失,只留下一個空細胞壁(圖7),這一結果表明了lmd突變體中發生了典型的細胞程序性死亡。樺樹葉片上有許多葉腺,在葉片成熟后會退化。由于lmd表現出葉片早衰現象,作者用掃描電鏡掃描葉片表面,以觀察lmd是否有變化。在第三個葉片上,發現lmd葉片上的葉腺體比NT和oe21葉片少(圖8)。SEM觀察表明,lmd確實發生了早衰。

圖6:切片顯示病變部位發生細胞死亡

圖7:投射電鏡觀察細胞超微結構

圖8:葉腺體結構觀察

3、轉錄組揭示lmd體內的分子水平變化
為了深入了解lmd體內的分子水平變化,作者進行了轉錄組測序。對差異基因進行分析發現了許多與致病相關的基因,如WRKY、谷胱甘肽-轉移酶(GST)、乙烯反應因子(ERF)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase),這些都已經被研究證實與防御反應相關。GO富集分析顯示,參與催化活性、抗氧化活性、免疫系統過程和刺激響應的差異基因發生了顯著富集(圖9)。

圖9:GO富集分析結果

4、lmd體內過氧化物積累
許多LMM壞死病變的形成都與ROS相關。為了確定lmd的程序性細胞死亡是否伴隨著活性氧的產生,作者進行了DAB染色和DCFH-DA染色,結果顯示lmd體內積累了較多的過氧化物(圖10)。

圖10:DAB染色與DCFH-DA染色結果

5、lmd突變體對Alternaria alternata(煙草赤星病菌)具有較強抗性
研究發現類病變突變體增強了對病原菌的抗性,為了測試lmd突變體是否對Alternaria alternata有抗性,作者將孢子懸浮液噴灑在NT、oe21和lmd幼苗上。7天之后,NT和oe21感染嚴重,出現了幾片枯萎葉片,而在lmd突變體中觀察到的枯萎葉片很少,盡管其葉片上有許多病變(圖11)。噴施17天后,NT和oe21的發病率均在90%以上,但lmd仍未出現感染葉片。lmd的發病時間出現在噴灑后22天,而此時,lmd的發病率為45.55%,但NT和oe21的發病率均為100%(圖12)。

圖11:感染Alternaria alternata后NT、oe21、lmd的表型

圖12:發病率統計結果

6、揭開lmd的廬山真面目
前面提到過,作者構建了21個BpGH3.5超表達株系,由于其他20個BpGH3.5株系沒有顯示與lmd相似的表型,因此lmd的表型不是BpGH3.5過表達的結果,而是與T-DNA插入有關。作者通過基因組重測序與TAIL-PCR證實lmd基因組上有兩個T-DNA插入位點,其中一個插入位點位于BpEIL1啟動子區域,導致BpEIL1表達水平顯著下降,這可能是導致lmd出現類病變表型的主要原因。

創新點
類病變突變體在水稻、玉米、擬南芥等植物中研究較多,但在木本植物中卻鮮有報道,本研究通過轉錄組手段研究了樺樹lmd突變體產生類病變表型的分子機制,為進一步研究木本植物類病變基因提供了基礎。

讀后感
故事到這就結束了,讀完這篇文章后,小編最大的感想就是“無心插柳柳成蔭”,偶然獲得的超表達株系表現出獨特的表型,并借用轉錄組與生理實驗的手段,作者解開了圍繞在lmd身上的神秘面紗。突然想起了一句話,千萬別擔心生物學沒有科研方向,隨便一個坑就能給你一條路!年關將至,各位奮斗在科研路上的大咖們,您的年終匯報準備的咋樣了?

參考文獻
Li R, Chen S, Liu G, Han R, Jiang J. Characterization and Identification of a woody lesion mimic mutant lmd, showing defence response and resistance to Alternaria alternate in birch. Sci Rep. 2017 Sep 12;7(1)

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