蛋白組研究中的iTRAQ技術

一萬年太久,只爭朝夕,就讓一個億隨風去吧,新的一年我們不僅餃子要吃飽,文章也要發表,蛋白組文章來一波~

1.蛋白組研究簡介
蛋白質是生理活動的執行者,是生命現象的直接體現者,對蛋白質結構和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。對細胞或組織的全蛋白質表達譜進行系統分析的蛋白質組學,是目前發展最迅速的組學研究之一,已被廣泛用于生長發育、抗逆性狀改良、免疫互作、藥物作用機制、生物標志物發現等的研究。
所謂“工欲善其事,必先利其器”,科學研究也一樣,下面就給大家介紹一下已被廣泛應用到蛋白組研究中的iTRAQ技術。

2.iTRAQ技術介紹
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術是由美國應用生物系統公司ABI研發的一種多肽體外標記技術。該技術采用4種或8種同位素的標簽,通過特異性標記多肽的氨基基團,而后進行串聯質譜分析,可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量。

圖1 iTRAQ技術簡介

iTRAQ試劑由三部分組成:報告基團;質量平衡基團和肽反應標記試劑基團,可形成4種或8種相對分子質量均為145的等量異位標簽。

圖2 iTRAQ試劑標記肽段

iTRAQ試劑標記酶解后的肽段,可與氨基酸N端及賴氨酸側鏈連接的胺標記同重元素(isobaric)。在一級質譜圖中,任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。在串聯質譜中,報告基團斷裂下來產生報告離子,根據報告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。

3.iTRAQ文獻
據不完全統計,通過iTRAQ技術進行大規模蛋白質研究,發表的文章已達到2500+,通過iTRAQ技術進行蛋白組研究發表文章,接收率還是非常高的~下面iTRAQ文章簡介來一波~

01 抗逆性狀改良
植物在遇到各種環境侵害(如高溫、低溫、干旱、高鹽、高滲透壓、臭氧及機械損傷等)時會發生應激保護措施。這些脅迫可以引起大量的蛋白質在種類和表達量上的變化,通過對耐旱能力不同的小麥品系進行定量蛋白質組學研究可以了解小麥對脅迫的適應機制。

實驗設計:
小麥抗旱品種Opata,小麥耐旱品種Nesser,兩個品種。
取正常培養及ABA處理條件后的根,共4組。
測序策略:
iTRAQ(三個生物學重復,采用三個iTRAQ4標)、LC-MS/MS、qRT-PCR。
研究結果:
1、利用iTRAQ方法共鑒定出1656個蛋白,其中936個為顯著差異蛋白。
2、從差異分析結果中,篩選出抗旱能力不同的小麥中特有蛋白(同時對ABA處理有響應);通過qRT-PCR的方法進行驗證。
文章亮點:
除了對相同作物不同品系與處理條件進行的蛋白組比較研究,本研究的小麥蛋白組數據庫采用多個不同的小麥數據庫,極大提升了蛋白鑒定數量。

02 動物生長發育
豬肉的生長速率和肉質是其最重要的兩個經濟學指標,由多種基因和生物學通路調控,通過蛋白組學研究可以充分了解動物生長發育相關蛋白,為品質改良打下基礎。

實驗設計:
中國本土品種:藏豬(TP)、滇南小耳豬(DSP)。
西方引進品種:約克豬(YY)和長白豬(LL)的背最長肌樣本。六月齡取樣,以尋找參與豬肌肉生長和脂肪沉積的關鍵蛋白。
測序策略:
iTRAQ(兩個生物學重復,采用一個iTRAQ8標)、LC-MS/MS、PRM分析技術。
研究結果:
作者應用iTRAQ對四組樣本進行蛋白質組學分析,鑒定出了4815個多肽,對應969種蛋白。在這之中有288種為差異性表達蛋白(DEPs),其中169種蛋白在TP-DSP組上調,119種下調。
作者隨即對這些DEPs分別進行了GO和KEGG分析,篩選出了28種與肌肉生長相關和15種與脂肪沉積相關的蛋白。
文章亮點:
本文最后應用PRM對iTRAQ的分析結果進行驗證,由于此方法需要目標蛋白有樣本中唯一的多肽作為標記,因此只對其中的12種蛋白進行了PRM分析,結果均與iTRAQ一致,提高了實驗結果的可信度。

03 免疫互作
玉米作為世界范圍內主要作物,受昆蟲攻擊造成巨大的生產損失。文章旨在研究玉米受食草昆蟲攻擊的響應機制,著重分析與機械損傷相比,食草昆蟲的口腔分泌物對植物-昆蟲之間互作所起的作用。

實驗設計:
W組:未處理的玉米葉片;W+W組:20 μL水處理V3期玉米機械損傷的葉片;
W+OS 組:20μL口腔分泌液處理V3期玉米機械損傷的葉片。
測序策略:
轉錄組測序(三個生物學重復):W+W組和W+OS 組,處理1.5h、6h。
iTRAQ蛋白定量技術(三個生物學重復)。
靶向代謝組:激素表達水平檢測,篩選測序時間點;非靶向代謝組。
研究結果:
4406個差異表達的基因中,4142個基因沒有檢測到相應的蛋白表達,只有64個基因在蛋白水平上有明顯變化。差異表達的蛋白有294個,其中214個在轉錄水平上沒有顯著差異,推測這些蛋白很可能存在轉錄后修飾。
文章亮點:
文章利用多組學(轉錄組學、蛋白組學、代謝組學)技術聯合分析玉米受植食昆蟲攻擊后的響應機制,并構建繪制了系統的調控模型。這些數據對玉米防御昆蟲災害的進一步遺傳學研究搭建了很好的框架,也為抗昆蟲災害的玉米新品種的培育奠定了良好的基礎。

4.轉錄組數據構建蛋白庫

廣大人民群眾喜聞樂見的餃子餡料,比如韭菜、茴香和大白菜等,至今還基本沒有進行蛋白組研究。作為百合科植物,韭菜的基因組較大,至今都沒有其基因組信息發表出來,公共數據庫中的信息也很少,所以關于韭菜的基因檢測研究一直都是個空白。
類似韭菜這種研究結果比較少的物種,可以采用轉錄組+蛋白組的測序方式,用轉錄組數據構建蛋白組數據庫,后期進行蛋白的定性及定量,對蛋白鑒定數量的提升也有很大助力。

參考文獻
[1]Wang Z, Peng S, Li Q, et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs[J]. Sci Rep, 2017, 7:46717.
[2]Alvarez S, Choudhury S R, Pandey S. Comparative Quantitative Proteomics Analysis of the ABA Response of Roots of Drought-Sensitive and Drought-Tolerant Wheat Varieties Identifies Proteomic Signatures of Drought Adaptability[J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(3):1688-701.
[3]Qi J, Sun G, Wang L, et al. Oral secretions from Mythimna separata insects specifically induce defense responses in maize as revealed by high-dimensional biological data[J]. Plant, 2016, 39(8):1749.

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