【成功案例】多組學研究套路之:微生物多樣性16S測序+宿主轉錄組測序

英文題目:Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice
中文題目:小鼠慢性高鹽喂養誘導的與腸道生態失調相關的腸道屏障破壞引起早期腎損傷
發表雜志:Experimental & Molecular Medicine
影響因子:5.063
合作單位:南方醫科大學病理生理學系

01.研究背景

高血壓的患病率不斷增加,正在成為世界各地的主要公共衛生問題。高血壓的發病機制尚不完全清楚。慢性高鹽飲食相關的腎損傷是高血壓發展的關鍵風險因素。然而,高鹽攝入引發腎臟損害的機制知之甚少。

暴露于食用鹽的第一個器官是腸道。腸道異常(包括腸道生態失調和腸道通透性增加)與許多腸外疾病有關。例如,飲酒可誘發腸道生態失調,并可破壞腸道屏障完整性,從而使病原體相關分子滲入血液并轉移至肝臟,導致肝臟脂肪變性和進一步酒精性肝炎。基于這一理論,作者旨在研究高鹽攝取是否能夠直接破壞腸內穩態,并反過來引發早期腎損傷。

02.研究方法

1、取材:
? 6-8周齡雄性無病原體的C57BL / 6小鼠
? 飲用水中添加2%NaCl,連續飼喂小鼠8周,以誘導早期腎損傷
? 對于抗生素實驗,將多粘菌素B(150mg / l)和新霉素(200mg / l)連續添加到NaCl飲用水中喂食8周

2、測序
? 糞便樣本(盲腸內容物)或回腸/結腸粘膜層分離細菌——16S測序
? 回腸和結腸組織——轉錄組測序

03.研究結果

1、慢性高鹽攝入導致腸道生態失調
慢性高鹽HS喂養后,盲腸中的總細菌負荷略微降低。分離不同部位的菌群,慢性HS喂養后,回腸上皮和結腸腔內的細菌負荷也降低。

慢性HS處理顯著降低厚壁菌門水平,并提高擬桿菌門的水平,這表明菌群組成在HS攝入后發生改變。

16S rRNA測序表明, HS組的盲腸內容物(cecal content)菌群組成與對照小鼠相比,在門和綱水平上明顯不同。特別是在HS處理后,盲腸內容物中放線菌門和厚壁菌門中的Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes以及綱水平中的Actinobacteria,Clostridia和Bacteroidia所占比例顯著改變。使用未加權的uniFrac分析的主坐標分析(PCoA)顯示,HS組和對照組盲腸內容物菌群分別聚類(P = 0.002,ADONIS分析)。粘膜細菌也是影響腸道病理生理狀態的重要因素,回腸粘膜( ileal mucosa)和結腸粘膜(colonic mucosa)在整個胃腸道中的細菌數量最多。因此,進一步分析了位于回腸粘膜層和結腸粘膜層的細菌。未加權的uniFrac分析顯示,HS組和對照組在回腸粘液層分別聚類(P = 0.014,ADONIS分析)。而在結腸粘液層,對照組和HS組也形成兩個聚類類別,分離趨勢明顯(P =0.05,ADONIS分析)。

2、慢性高鹽喂養導致以炎性反應受損為特征的腸道異常
對照組和HS喂養組小鼠的回腸和結腸上皮形態無明顯差異,同時,慢性HS喂養不影響腸中的細胞死亡。炎癥標志物的表達隨著慢性HS攝入發生顯著改變。特別是,Ccl4、Ccl5和IFN-γ在HS小鼠的回腸中表現出更高的mRNA表達水平。回腸中IFN-γ免疫組織化學的結果也進一步證實了這一基因表達數據。由于TLR家族蛋白和Nf-κB是參與病原體相關免疫反應的主要分子,作者進一步評估了TLR家族和Nf-κB基因表達,發現TLR2、TLR3和TLR5 在回腸中趨于更高的mRNA表達水平。HS處理后IRF7、GATA3和NFKB2的表達顯著上調。HS喂養后,回腸中CD38的表達升高。
通過二代測序進行轉錄組測序分析,比較對照組和HS組之間涉及“細胞因子-細胞因子受體相互作用”、“NF-κB信號通路”和“Toll樣受體信號通路”的所有相關基因的表達。結果表明回腸和結腸中,兩組之間許多基因的表達存在差異。

3、慢性高鹽攝入導致腸道屏障功能喪失,并促進細菌移植進入腎臟
通過糞便白蛋白含量檢測腸通透性,結果顯示HS喂養促進腸道滲漏。同時,HS攝入顯著降低結腸中的tjp-1、tjp-2、claudin-1、claudin-7和claudin-8基因表達。此外,與對照小鼠相比,HS攝入后,回腸和結腸中形成屏障的緊密連接ZO-1蛋白的表達水平顯著降低以及結腸中的Occludin蛋白顯示出顯著較低的趨勢。另一方面,在HS喂養后,回腸和結腸中“成孔”緊密連接蛋白Claudin-2蛋白的表達顯著升高。這些數據清楚地表明腸道屏障被慢性HS攝入所破壞。
腸道通透性增加可能導致腸道細菌或細菌產物易位至腸外組織。通過使用16s PCR來識別細菌DNA,檢測腎臟、肝臟和脾臟中的細菌易位。有趣的是,慢性HS攝入促進了細菌易位進入腎臟,但不會進入肝臟或脾臟。LEfSe試驗結果表明,與對照組相比,HS處理的腎臟中富含屬于腸道細菌的桿菌。與對照動物的腎臟相比,在HS喂養的腎臟中,芽孢桿菌(Bacillus)和游動微菌(Planomicrobium)分別增加了2.6倍和8.7倍。

4、慢性高鹽喂養相關的腸道屏障破壞和腎損傷取決于腸道微生物菌群
給予小鼠抗生素(多粘菌素B和新霉素,antibiotics,ABX)處理后,恢復了HS喂養誘導的回腸IFN-γ的過表達和腸道滲漏。通過尿和血漿Na +濃度測量,發現抗生素并不改變鈉負荷。HS喂養增加了血漿肌酐(creatinine)水平,與HS治療相比,抗生素治療后具有較低但不顯著的血漿肌酐水平。HS喂養小鼠的腎功能障礙主要標志物–尿白蛋白/肌酐比率顯著增加,但抗生素治療幾乎可以完全恢復腎功能。抗生素施用還可以降低HS誘導的凋亡細胞升高。以上結果表明,抗生素治療能夠改善HS喂養引起的腸道滲漏和早期腎損傷。

5、慢性高鹽喂養引起的收縮壓升高取決于腸道微生物菌群
慢性HS喂養可能導致動脈壓升高。 雖然HS處理的小鼠的舒張壓(DBP)和平均血壓沒有增加,但收縮壓(SBP)在慢性HS喂養后顯著升高。有趣的是,抗生素治療能夠完全恢復正常SBP。這些數據強烈表明,慢性HS喂養引起的SBP升高取決于腸道微生物菌群。

6、慢性高鹽處理的小鼠的腸道微生物菌群可以獨立地引起腸道泄漏和早期腎損傷
糞便微生物菌群移植實驗:喂食正常飲食的兩組小鼠口服來自對照和HS處理的小鼠的糞便。移植8周后,接受對照糞便的對照小鼠中的微生物菌群組成改變的主要標記物–盲腸厚壁菌/擬桿菌比例明顯高于接受HS糞便的小鼠,這一點與作者之前的數據一致,表明HS喂養會降低盲腸中的厚壁菌 / 擬桿菌比例,并說明了糞便微生物菌群移植實驗是成功的。給藥4周后,糞便白蛋白含量檢測結果表明,接受HS喂養糞便的小鼠的腸通透性顯著增加。并且,尿白蛋白(albumin)/肌酸酐(creatinine)比率(在當前研究中觀察到的腎功能障礙的主要表型),在移植4周后接受HS喂養的糞便的小鼠中也顯著增加。最后,與對照小鼠相比,HS糞便移植小鼠中的腎臟凋亡細胞數量顯著增加。

小 結
該研究通過使用依賴于微生物菌群的“腸-腎軸”理論為研究鹽相關性高血壓的發病機制提供了新方向。未來的工作將重點關注腸道細菌與鹽誘導的高血壓的發病之間的聯系,將詳細說明細菌的應答或細菌中的代謝途徑,這些細菌參與并促進由鹽誘導的腸道和腎臟病理變化,并且此文中在“腸-腎軸”中的新發現將提供潛在的高血壓干預治療目標。

 

參考文獻
Hu, Jingjuan, et al. “Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice.” Experimental & molecular medicine 49.8 (2017): e370.

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