【案例解讀】蛋白組學iTRAQ和label-free的技術應用

遺傳物質從DNA、RNA到蛋白質的過程,受到不同水平的表達調控,如表觀調控、轉錄調控、翻譯調控等。蛋白質是生理活動的執行者,是生命現象的直接體現者,蛋白質組學的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。同時結合mRNA的研究可以比較分析基因在轉錄和翻譯不同水平的調控機制。
iTRAQ和label-free是目前定量蛋白質組學常用的技術。其中,iTRAQ技術是一種蛋白體外標記定量技術,利用多種同位素特異性標記蛋白的氨基集團,進行質譜串聯分析,從而比較不同樣品蛋白質的相對含量。另外非標定量法(label-free)是一種不依賴于同位素標記的新型蛋白質定量技術,通過比較質譜分析次數或質譜峰強度,分析不同樣品蛋白的數量變化。相比于label-free,iTRAQ的蛋白通量及結果準確性都更高。今天咱們通過實際案例來具體了解一下它們的用途。

案例一: Proteomic analysis reveals strong mitochondrial involvement in cytoplasmic male sterility of pepper (Capsicum annuum L.)
實驗方法:Label free
發表雜志:Journal of Proteomics,IF:3.867
見刊時間:2017.8
樣本:辣椒花蕾
文章概述:這是一篇很典型的應用label-free蛋白質組學方法研究花粉發育和雄性不育相關分子機制,共定性定量了324個差異表達蛋白,組織學實驗表明花粉中絨氈層細胞的程序化凋亡是雄性不育的最重要的原因。蛋白質組學的生物信息分析結果表明參與花粉外壁形成、丙酮酸代謝、三羧酸循環、線粒體的電子傳輸及氧化應激反應都可能和細胞敗育有關。我們的研究為研究辣椒育種提供了研究的基礎。

案例二: ProteomeAnalysis of Potential Synaptic Vesicle Cycle Biomarkers in the Cerebrospinal Fluidof Patients with Sporadic Creutzfeldt–Jakob Disease
實驗方法:iTRAQ
發表雜志:Molecular Neurobiology(分子神經生物學),IF:5.397
見刊時間:2016.8.25
樣本:腦脊液
文章概述:克雅氏病是一種致命的神經退行性疾病,發病迅速,至今仍不明確它的發生機制;而突出囊泡通路被認為與許多神經性疾病相關。研究者選用了20例克雅氏病病人和13例正常人的腦脊液,進行了iTRAQ差異蛋白質組學研究,從中篩選出了在疾病中表達異常的蛋白。從而篩選得到了參與該病發展突觸囊泡循環通路中的潛在分子標志物。研究結果發現突觸囊泡通路在克雅氏病中發揮著重要作用,并且通過蛋白質組學的技術手段,鑒定到了參與此通路的6個關鍵蛋白:AP2A1,SYT1,SNAP25,STXBP1,CLTB,Rab3a,緊接著利用Western Blot的方法驗證了這些蛋白的表達量差異。借助這項研究,研究者們希望能夠幫助篩選明確的分子標志物,來幫助預測sCJD的發生。

案例三:iTRAQ-based quantitative proteomic analysis for identification of biomarkers associated with emodin against severe acute pancreatitis in rats
實驗方法:iTRAQ
發表雜志:RSC Advances,IF:3.108
見刊時間:2016.6
樣本:大鼠
文章概述:本文是一篇很典型的利用蛋白質組學技術(iTRAQ)發表在Royal Society of Chemistry上的文獻,研究大鼠SAP造模后及大黃素治療后蛋白質層面的表達差異,旨在篩選出大黃素對SAP作用的生物標記物。作者篩選出了32個潛在標記蛋白并對其進行了GO功能注釋,接著將目光鎖定在HTRA1這種新發現的標記物,并經過Western blot證實了其與SAP及大黃素的密切關系。最后提出了大黃素通過抑制HTRA1/TGF-β信號通路來治療SAP的假說,為揭示大黃素對SAP治療的分子機制提供了新的思路。

案例四:Comparative transcriptomic and proteomic analyses provide insights into the key genes involved in highaltitude adaptation in the Tibetan pig
實驗方法:RNA-seq, iTRAQ質譜定量分析,
發表雜志:Scientific Reports,IF:5.228
見刊時間:2017.6
樣本:豬的心臟組織
文章概述:本文是一篇很典型的利用轉錄組測序技術和蛋白質組學技術(iTRAQ)發表在Scientific Report上的文獻,研究高原地區和平原地區藏豬和約克郡豬心臟組織的轉錄組和蛋白組的差異。旨在研究高原動物適應極端環境的機制。多組學聯合方式揭示了環境適應分子機制的關鍵蛋白A2M, PDLIM3, CRYAB, ACE及參與的信號通路HIF-1,心血管發育,VEGF等信號通路,這些信號通路可以與藏豬的環境適應機制有關,為了解人類缺氧性相關疾病的發病機制提供了很重要的參考。

案例五:Comparative proteomics to reveal muscle-specific beef color stability of Holstein cattle during post-mortem storage
實驗方法:Label free
發表雜志:Food chemistry IF:4.052
見刊時間:2017
樣本:牛肌肉
文章概述:本文利用了非標記定量(Label free)蛋白質組學的方法,研究發現,腰大肌在宰后貯藏過程中的高鐵肌紅蛋白明顯高于背最長肌,但后者的肉色保持較好。生物信息學分析發現,背最長肌的豐度較高的蛋白主要與抗氧化、保護和修護有關,而腰大肌的豐度較高的蛋白,主要比TCA循環、線粒體電子傳遞鏈相關,從而導致了兩者肉色變化的差異性。

案例六: Unraveling proteome changes of Holstein beef M. semitendinosus anditsrelationship to meat discoloration during post-mortem storage analyzedbylabel-free mass spectrometry
實驗方法:Label free
發表雜志:Journal of Proteomics IF:3.867
見刊時間:2016
樣本:牛半腱肌
文章概述:
本文利用了非標記定量(Label free)蛋白質組學的方法,探究牛半腱肌在不同儲存時間(0天、4天和9天)其蛋白組的變化,同時尋找與肉色變化相關的差異蛋白。研究發現,宰后貯藏過程中牛肉色逐漸劣變,高鐵肌紅蛋白的含量不斷上升,肉色由鮮紅色轉變成褐色。不同儲存天數下,共找到了118個差異蛋白質,其中18個差異蛋白質與牛肉的顏色聯系密切,生物信息學分析發現,這些蛋白主要與糖酵解、能量代謝、電子傳遞和抗氧化功能等生物進程相關。

案例七: Comparative Proteomics Analysis of Phloem Exudates Collected during the Induction of Systemic Acquired Resistance
實驗方法:Label free
發表雜志:Plant Physiology IF:6.456
見刊時間: 2016
樣本:擬南芥
文章概述:系統獲得抗性Systemic acquired resistance(SAR)是植物受到局部感染初期產生的一種防御反饋,它為未受感染的區域提供了長效的、全局性的抗病保護。研究人員以擬南芥的韌皮部汁液為研究對象,選取了空白組(Mock)、高病毒感染組(virulent Pst)、低毒感染組( avirulent Pst )用于高通量定量蛋白組學的實驗分析。富集到與 SAR 相關的蛋白如 THIOREDOXIN h3,ACYL-COENZYME A-BINDING PROTEIN6 , PATHOGENESIS-RELATED1,同時也發現一系列與SAR相關的新蛋白,此外,研究人員除了富集擬南芥SAR過程的信號通路,還將鑒定到的韌皮部汁液蛋白組與數據庫中南瓜和矢車菊的韌皮部汁液蛋白組數據做了比較,發現盡管物種間鑒定到的蛋白組差異較大,但在SAR調控下的蛋白確有相通之處!

案例八:Quantitative proteomics and transcriptomics reveal key metabolic processes associated with cotton fiber initiation
實驗方法:iTRAQ+RNA-seq
發表雜志:Journal of Proteomics IF:3.867
見刊時間:2015
樣本:棉花胚珠
文章概述:
利用iTRAQ蛋白質組學技術和RNA seq技術,揭示參與棉花纖維形成的關鍵代謝通路。共鑒定并量化了5884種可能參與纖維細胞起始的蛋白質。發現了兩個編碼3-羥基酰基-CoA脫水酶的棉花PAS2基因。 VLCFA生物合成通過關鍵基因的轉錄激活來調控纖維的生長和發育。 本研究提供了纖維初始細胞的轉錄組學和蛋白質組學數據,增加了對控制纖維細胞分化和早期棉花纖維發育的分子過程的理解。
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