淺談 lncRNA的研究思路

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長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200 nt的RNA分子,位于細胞核或胞質內,lncRNA一直以來都是科研領域的熱點,吸引著眾多研究者的目光。長鏈非編碼RNA按照其來源可分為Antisense lncRNA (反義長非編碼RNA),Intronic transcript (內含子非編碼RNA),Long intergenc noncoding RNA(lincRNA),Promoter-associated lncRNA(啟動子相關lncRNA),UTR associated lncRNA(非翻譯區lncRNA)五種類型。lncRNA在轉錄前、轉錄水平與轉錄后水平上均具有重要作用。在整個基因組轉錄產物中,lncRNA所占的比例遠遠超過編碼RNA所占的比例,與人類和動物相比,植物lncRNA研究仍處于起步階段,植物lncRNA的研究可能揭示控制植物生長和分化的未知新機制,lncRNA在植物開花、雄性不育、營養代謝、生物和非生物脅迫等多種生物過程中起著調節因子的作用。隨著高通量測序技術的發展,越來越多的lncRNA被鑒定出來,但具體的作用與功能仍然不是很清楚,因此lncRNA的研究領域依然是一片非常廣闊的神秘區,具有極大的研究價值。

lncRNA的研究主要分為三大步驟:

 

  • 1、lncRNA的篩選
  • 2、lncRNA的驗證
  • 3、lncRNA的功能研究

1、lncRNA的篩選

基于鏈特異性建庫的RNA-seq能夠對不同組織或樣本的lncRNA進行測序,通過對轉錄本編碼潛能進行篩選,判斷其是否具有編碼潛能,從而可以判定該轉錄本是否為lncRNA,并識別不同樣品(或樣品組)之間顯著差異表達的基因或lncRNA。

4種lncRNA篩選方法維恩圖


差異表達lncRNA聚類熱圖

2、LncRNA的驗證

通過測序結果確定相關lncRNA后,可以通過NONCODE或者lncRNAdb等網站進一步了解lncRNA的相關信息,比如lncRNA的長度,染色體所在位置與特異性表達信息。

lncRNA的全長序列一般通過RACE實驗來獲得,5’RACE獲取5’全長,3’RACE獲取 3’全長,最終拿到完整的lncRNA序列。


RACE實驗擴增lncRNA[1]

lncRNA的表達分析可以通過定量PCR或者Northern blot驗證,在不同組織或樣本中檢測表達差異,為篩選研究目標lncRNA打下基礎。這里還要提一下lncRNA的分子定位分析,這些非編碼RNA的定位分析對深入了解他們的功能是至關重要的,因為這可能決定了lncRNA的調控機制。眾所周知,lncRNA可以在轉錄水平或轉錄后水平來調控基因的表達,當lncRNA位于細胞核內時,是在轉錄前或轉錄水平上來影響基因的表達,因此在這種情況下再提出當前研究較火熱的ceRNA機制就不是那么合理了。對于lncRNA定位信息,可以通過查詢RNALocate數據庫或者相關分子實驗確定。


lncRNA的定位研究[2]

3、LncRNA的功能研究

通過高通量篩選出lncRNA只是研究的第一步,想要發高分文章,就必須對lncRNA的功能進行深入的探索。最基本的研究就是構建lncRNA超表達載體或通過siRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA,直觀地展現lncRNA具有的生物學功能。在明確了lncRNA具有的生物學功能后,就要從分子機制上解析其如何發揮的作用,無外乎三點:1)lncRNA與RNA相互作用,這里主要指的是lncRNA對其靶基因的調控;2)lncRNA與蛋白相互作用,RIP是研究RNA蛋白相互作用的重要手段,利用RIP可以研究在體內蛋白是否與lncRNA發生相互作用;3)lncRNA結合DNA序列,這是位于核內的lncRNA發揮調控作用的一種機制。

lncRNA超表達株系具有干旱抗性[2]

lncRNA在最初研究階段,普遍不認為其具備編碼能力,但最近幾年相繼有文章報道相關lncRNA能通過編碼小肽來發揮作用,一時間lncRNA編碼話題再次成為熱點。對于判斷lncRNA是否具備編碼潛能,首先要看該lncRNA是否具有核糖體結合位點與開放閱讀框,滿足這兩個先天條件后,還要通過多肽鑒定的分子實驗來進行驗證。

lncRNA依然是科研領域熱點之一,現在來說,簡單篩選某一物種的lncRNA很難發表高分文章,下游功能驗證研究越來越被重視,對文章影響因子有期待的老師,做好下游實驗一定會給文章增光添彩。

參考文獻:

[1] Gong,Chen guang,Li,et al.A Long Non-coding RNA,LncMyoD,Regulates Skeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation[J].Developmental Cell,2015.

[2] Tao Qin,Huayan Zhao,Peng Cui,Nour Albesher,Liming Xiong.A Nucleus-localized Long Non-Coding RNA Enhances Drought and Salt Stress Tolerance.Plant Physiology,2017.

 

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