成功案例 | 百邁客助力草莓果色基因克隆

草莓枝葉和果實的顏色是由于液泡中的花青素積累形成的,但影響花青素積累的基因調控機制研究較少。近日,Journal of Experimental Botany在線發表了百邁客與華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室康春穎教授的合作文章,該研究以BSA混池測序的方法為基礎對野生草莓種突變體進行分析,成功克隆到影響葉片和果實著色的RAP基因并對其功能進行驗證,下面圖譜君就為您帶來該文章的解讀。

文章題目:RAP codes for a GST anthocyanin transporter that is essential for the foliage and fruit coloration in strawberry

合作單位:華中農業大學

雜志:Journal of Experimental Botany

 

基因定位材料與方法

材料:

親本YW5AF7(野生型)和rap(ENU突變體)

F2群體,27(野生表型)+18(突變表型)混池;

測序平臺:Illumina HiSeq X Ten

關聯方法:SNP index

驗證方法:PCR擴增 + Sanger測序

 

結果分析

1. 表型鑒定

作者利用ENU誘變產生了綠色葉柄和葉片的突變體rap,相較與野生型YW5AF7,rap表皮細胞的色素沉著大大減少,葉柄的橫截面脈管系統周圍皮層細胞中顯示出相同的變化,且與色素減少表型相一致的是rap葉片葉柄中總花青素含量顯著降低(P <0.01),rap和YW5AF7對照果實中花青素含量都極低(圖1)。通過對已知花青素合成途徑相關基因表達及測序分析,RAP為一新基因參與花青素的積累,調控草莓的生長發育。

圖1 表型鑒定

2. 基因定位

利用rap與YW5AF7雜交產生F2群體,突變體與野生型植物的比例接近1:3,說明rap由隱性單位點控制。應用BSA方法,將F2群體18株突變表型及27株野生表型植株植物全基因組重測序,在突變體和野生混池中分別獲得43.3M和48.5M reads。共找到64個SNP位點與表型相關聯。其中,在基因間區域有41個,內含子有11個,UTR有3個,編碼序列有9個。作者重點關注了9個編碼區的SNP差異(圖2),其中8個位點導致同義突變或錯義突變,僅一個SNP(C到T)導致基因31672的提前終止,通過PCR擴增和Sanger測序在50個F2 rap突變體中單獨檢測該SNP,所有個體都均表現出純合突變。此外,RAP的表達水平在rap葉柄中大大降低,將gene31672確定為RAP主要的候選基因。

圖2 突變位點及表達量檢測

3. RAP 功能研究

RAP 編碼谷胱甘肽S-轉移酶(GST),F. vesca中有的7個GST同源基因,它們被命名為RAP-L1到RAP-L7,qRT-PCR表達量分析表明,RAP主要在果實中表達較高。為了探索它們對果實著色的貢獻,分別在果實成熟的過程的4個發育階段檢測RAP與其它同源基因的表達趨勢,RAP-L4在綠色階段是表達最豐富,RAP從著色階段開始表達,且表達量較高(圖3)。

圖3 表達量檢測

以上結果表明RAP相比與其它同源基因,在草莓著色發育階段發揮更重要的作用,構建35S::RAP-RFP 載體轉化rap 同源突變體tt19-7,可以互補tt19-7表型,RAP-RNAi 轉化材料和對照相比,花青素含量降低,研究發現RAP位于果實特異轉錄因子FvMYB10的下游發揮作用,調控果實顏色。

總結

本文應用F2群體中27+18的混池BSA分析,通過對候選區段SNP注釋分析,成功克隆到RAP基因,它編碼谷胱甘肽S-轉移酶,參與草莓葉柄及果實花青素的積累,調控葉色及果色形成,后期可用于草莓果色輔助性育種。

 

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