三代測序輕松破譯水稻6mA甲基化!

2018年11月14日中國農業科學院生物技術研究所谷曉峰研究團隊與百邁客共同合作研究項目“N6-MethyladenineDNA Methylation in?Japonica?and?Indica?Rice Genomes and Its Associationwith Gene Expression, Plant Development and Stress Responses”在著名雜志Molecular Plant上在線發表!通訊作者為谷曉峰研究員。谷老師是中國農業科學院生物技術研究所研究員,博士生導師。圍繞發育和產量開展表觀遺傳學研究,發現多個通過RNA修飾、DNA甲基化、組蛋白修飾等機制調控生育期的新機制。在Molecular Cell、Developmental Cell、PLoSBiology等國際著名學術期刊上發表文章20余篇。

英文題目:N6-Methyladenine DNA Methylation in?Japonica?and?Indica?Rice Genomes and Its Association with? ?Gene Expression, Plant Development and Stress Responses
中文題目:粳稻和秈稻基因組N6-甲基腺嘌呤DNA甲基化及其與基因表達、植物生長和應激反應的關系
發表雜志:Molecular Plant
影響因子:9.326
發表時間:2018.11.14
合作單位:中國農業科學院生物技術研究所

研究背景

N6-甲基腺嘌呤(6mA)是在真核生物和原核生物中發現的最豐富的DNA修飾之一,6mA的研究主要集中在其在原核生物中的功能。近年來,動物真菌擬南芥和綠藻的研究開始揭示6mA甲基化的全基因組模式及其在真核細胞中調節基因表達的作用。6mA在植物中的生物學功能在很大程度上是未知的,水稻是世界上最重要的作物之一,也是分子和遺傳學研究的模式物種,以擴展我們在植物中6mA的知識。

研究材料

粳稻日本晴栽培種Japonica?Nipponbare (Nip) ;秈稻栽培種?Indica?93-11

研究方法

Denovo:PacBio RSII (Nip:117X;93-11:116X);Illumina (Nip:129X;93-11:41X)
Dot blot 分析;LC-MS/MS分析;6mA-IP-Seq;6mA-IP-qPCR;6mA-RE-qPCR;RNA-seq(IlluminaHiSeq X-ten); PacBioSMRT檢測6mA;CRISPR-Cas9誘變。

研究結果

? 粳稻Nip與秈稻93-11基因組更新
? ? ? 利用PacBio對Nip和93-11進行測序及Illumina平臺進行gap填充和誤差校正后,Nip基因組大小為380.7 Mb(contig N50=16.97Mb),93-11基因組大小為396Mb(contig N50=9.64Mb)。新組裝的Nip和93-11基因組的contig N50分別比先前公布的高2.2倍和460倍。與先前的參考基因組的比較顯示,新的組裝序列分別與之前公布的基因組有~98%的序列同一性。Nip中的gap數從905個大幅減少到18個,以及93-11中的gap從54600個減少到65個。PCR分析獨立驗證了Nip和93-11的所有染色體中隨機選擇的48個gap-closures。還糾正了93-11中幾個堿基的錯配,并通過PCR和Sanger測序進一步驗證。此外,基于串聯端粒重復序列的存在,大多數端粒位于染色體末端。新的基因組組合以及RNA-seq數據促進了基因注釋和基因間隔的改進。研究院分別糾正了Nip和93-11中的215和9843基因注釋錯誤,包括基因方向和基因結構的糾正,并鑒定了一些新基因。啟動子區的注釋也被更新(圖1)。

 

圖1.?水稻Nip和93-11基因組更新
? 水稻中6mA甲基化的廣泛性
LC-MS/MS結果顯示水稻幼苗的6mA含量在0.15%~0.55%之間,與小麥、玉米、高粱、小米及苜蓿相當。通過SMRT(單分子實時測序系統Single MoleculeReal Time)測序數據,在Nip和93-11中分別檢測出704875個和784912個6mA位點(每條鏈的覆蓋率≥25,質量值≥20)。超過90 %的6mA – IP – seq峰與至少一個由SMRT測序鑒定的6mA位點重疊,此外,6mA – IP – qPCR分析分別獨立驗證了從Nip和93- 11的12條染色體中隨機選擇的48個陽性和24個陰性基因座。甲基化水平高的位點顯示高富集度,而甲基化水平低的位點顯示低富集度。使用6mA-RE-qPCR驗證了帶有CATG motif的10個陽性和2個陰性的隨機選擇的基因組。表示了SMRT技術在6mA檢測中的可靠性。
Circos圖顯示Nip和93-11的12條染色體中廣泛分布6mA位點。6mA位點在染色體臂中部富集,尤其在著絲粒周圍異染色質區域附近富集,在染色體末端附近6mA密度較低。在未甲基化的腺嘌呤中,沒有觀察到這種模式,這表明基因組范圍的6mA分布在水稻基因組中不是隨機的。Nip(ANCBA)和93-11(ANMGA)最豐富的motif在兩端含有兩個保守的腺嘌呤,在中間含有一個胞嘧啶,類似于擬南芥的6mA motif。而第二個最富集的motif類似于在秀麗隱桿線蟲中鑒定的6mA motif(GAGG)(圖2)。

 

圖2.?水稻中6mA甲基化的廣泛性

? Nip和93-11的6mA甲基化基因

? ? ??47%的6mA位點位于Nip的基因體上,超過93-11中觀察到的(39%)。超過一半的6mA位點位于內含子中。在Nip啟動子、93-11基因間區和啟動子中6mA顯著富集。在gene body中,6mA在Nip和93-11的外顯子中富集。在Nip和93 – 11中分別有46106和46882個基因被6mA修飾,其中大部分是蛋白質編碼基因。通過比較同源基因,發現Nip和93 – 11共享大多數6mA修飾的基因。Nip中檢測到的6mA修飾基因甲基化水平高于93 – 11 。通過GO分析表明6mA可能是介導分子相互作用的表觀遺傳標記。文中進一步分析了轉座因子( TE )和不同家族重復序列周圍的6mA分布。6mA在class II起始位點、class I/SINE、 class I/LTR及未知轉座因子處富集,而其它家系則無明顯規律。這些模式在Nip和93-11之間是保守的(圖3)。

 

圖3.Nip和93-11的6mA甲基化基因
? 6mA與Nip和93-11中的活性表達基因有關
RNA-seq分析表明在Nip和93-11中,在6mA位點有大量的高表達基因甲基化,大量未甲基化基因在低水平表達。6mA甲基化基因的表達水平顯著高于非6mA基因,并且高表達基因顯示出較高的6mA占用率,特別是在啟動子和基因體區域中包含6mA位點的基因。6mA與水稻中的活性表達基因有關。5mC在水稻基因組中高豐度存在,影響基因表達,研究發現5mC和6mA之間沒有相關性(圖4)。

 

圖4. 6mA與Nip和93-11中的活性表達基因有關

? 水稻Nip、93-11和擬南芥6mA甲基體的比較

? ? ??水稻Nip、93-11和擬南芥中6mA分布模式有幾個關鍵特征:6mA位點廣泛分布于所有染色體上,在著絲粒周圍異染色質區域相對富集;在水稻中鑒定的富集motif與擬南芥中的motif非常相似;在水稻和擬南芥中均觀察到6mA在外顯子富集;6mA與水稻和擬南芥中的活性表達基因相關。在Nip,93-11和擬南芥中6mA甲基化同源基因比較發現:大約80%的6mA甲基化基因在Nip和93-11之間重疊,大約一半的水稻(Nip或93-11)的6mA甲基化基因與擬南芥的6mA甲基化基因的三分之二重疊。GO分析表明6mA參與不同生物體中的許多不同功能(圖5)。
圖5. 水稻Nip、93-11和擬南芥6mA甲基體的比較
? 6mA對Nip和93-11之間的環境脅迫具有敏感性、多樣性和動態響應
粳稻和秈稻對環境脅迫有不同的耐受性。Nip對冷和鹽脅迫表現出更大的耐受性,而93-11對熱脅迫表現出更大的耐受性。用LC-MS/MS分別研究了Nip和93-11幼苗在冷脅迫、熱脅迫和鹽脅迫下的DNA甲基化動力學,并探討了脅迫反應差異的潛在表觀遺傳學基礎。6mA水平在低溫脅迫下明顯降低,在高溫或鹽脅迫下顯著增加,而5mC水平保持穩定。6mA水平的變化在Nip和93-11之間表現出顯著的差異。水稻6mA含量與耐冷性呈負相關,與耐鹽性和耐熱性呈正相關(圖6)。
圖6. 6mA對Nip和93-11之間的環境脅迫具有敏感性、多樣性和動態響應
? 6mA與熱脅迫關鍵基因的表達呈正相關
根據SMRT測序結果,篩選出候選的6mA修飾的熱脅迫相關基因,如熱休克轉錄因子A1(HsfA1)和熱休克蛋白70(HSP70)。HSFA1是熱脅迫反應的主要轉錄調控因子,其在非脅迫條件下受到HSP70的抑制。HSFA1功能缺失導致熱脅迫敏感表型。HsfA1HSP70表達的變化與其6mA水平的變化呈正相關,這可能是Nip和93-11之間熱脅迫耐受性差異的原因。
? DDM1是水稻6mA修飾中不可缺少的
水稻基因組含有兩個DDM1同源基因DDM1aDDM1b,由于功能冗余,只有T-DNA插入單突變體產生的雙突變體DDM1a/1b表現出發育表型。然而,DDM1a/1b不產生活花粉,導致種子呈空殼和深色。用CRISPR-Cas9對Nip背景中的DDM1aDDM1b進行了有針對性的誘變,并鑒定了10個獨立的T1系用于DDM1aDDM1b單突變和4個獨立的DDM1a/DDM1b(1a/1b)雙突變型。在任何不同類型的DDM1aDDM1b純合子單突變體中均未觀察到表型。與野生型植物相比,所有純合1a/1b系表現出相同的矮化表型。1a-1/1b-1顯示出降低的結實率,而另外3個雙突變體顯示不育。LC-MS/MS對DNA甲基化水平的定量測量顯示6mA水平顯著降低,但1a/1b植物中5mC水平變化不大。6mA-IPqPCR分析顯示,6mA水平在大多數隨機選擇的位點中顯著降低。RNA-seq結果表明野生型中6mA修飾基因的表達水平顯著高于1a-1/1b-1植物中的相同基因,野生型中非6mA基因與1a-1/1b-1植物中的相應基因之間沒有表達水平差異。結果表明6mA水平與基因表達呈正相關。
6mA-IP-qPCR證實了野生型植物SMRT測序鑒定的6mA位點,1a-1/1b-1植物中6mA水平顯著降低。結果表明,抽穗期7(GHD7)、BR-缺陷矮稈1(BRD1)和DWF7的表達水平與其DDMa介導的6mA修飾相關(圖7)。
圖7.DDM1分

總結

該研究使用改進的水稻(Nip、93-11)基因組和SMRT測序,以單核苷酸分辨率鑒定了粳稻和秈稻基因組中全基因組的6mA位點。并報道了93-11中第一個6mA甲基位點;Nip和93-11中6mA位點在著絲粒周圍異染色質區域附近富集;6mA與水稻中的活性表達基因有關;Nip、93-11和擬南芥中6mA的分布及其與轉錄的關系是保守的。6mA與熱脅迫關鍵基因的表達呈正相關。篩選了與表觀遺傳學相關的潛在突變體,并發現DDM1對水稻中的6mA修飾是必不可少的。
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