快速克隆基因(二)

原文:

Jan Bettgenhaeuser, Simon G. Krattinger.Rapid gene cloning in cereals, Theoretical and Applied Genetics, 2018.

 

Positional cloning 2.0?怎樣避免在基因克隆上花費10年?

 

就像Xa21的克隆,圖位克隆一直是基因定位的有效方法,它的關鍵在于產生高分辨率的作圖群體應用于表型鑒定和基因分型,這對親本和創建合適的群體要求較高。今天,隨著測序技術、芯片技術的發展,開發出“海量”的SNP標記,當分子標記密度不再是克隆基因中的絆腳石,我們得關注其它問題并進行解決。以下總結3點:

??加速基因克隆的方法1-縮短群體構建時長

針對這個問題,作者總結出以下幾點:

第一:構建DH系,由單倍體加倍獲得的雙單倍體,可直接用于育種,極大地縮短育種周期。

第二:Speed breeding,它是一種縮短作物生長周期方法,采用了22:2小時的光:暗循環實現了大麥、小麥、豌豆等一年6代的生長繁殖,對油菜每年可增長至4代。近日,Nature Protocol發表了題為”Speed breeding in growth chambers andglasshouses for cropbreeding and model plant research”的研究論文,作者從光強、濕度、溫度及光周期等條件闡述了溫室中加速育種的方法,包括小麥、大麥、硬粒小麥、燕麥、蕓苔屬植物、豌豆、草豌豆、鷹嘴豆、二穗短柄草和藜麥等的快速生長的條件。

將DH系和Speed breeding相結合可大大縮減構建群體的周期。

??加速基因克隆的方法2-候選區段基因組裝

一旦將基因定位至一段遺傳區間內,此時會涉及到遺傳距離向物理距離,CM向bp的轉化,這也是圖位克隆的限速步驟,在大基因材料中表現的更明顯,此前它涉及了多輪BAC文庫篩選,例如,小麥中數百個基因抗病基因被定位,而只有幾十個被克隆。每個BAC克隆含有100-200 kb的DNA,這樣,覆蓋小麥基因組需要500,000個BAC克隆,且三個高相似度的基因組為對我們的篩選進行干擾,高質量的參考基因組可部分克服這種困難,仍存在由于BAC克隆所含片段大小的限制,圖位克隆已100-200 kb的速度步移著。如何解決這個問題?

2017年Thind提出了‘Targeted chromosome-based cloning via long-range assembly’(TACCA)的方法,利用Illumina測序得到的短片段序列,對其組裝,比較片段差異。利用此方法,成功在小麥中克隆了小麥抗葉銹病基因Lr22a

而Illumina讀長短,百邁客引入ONT?測序(OxfordNanopore Technologies,簡稱ONT)平臺,部分項目的結果中,平均reads長度幾乎均在20Kb以上(不同樣品DNA抽提難易程度不同,會造成一定的影響),最長readsN50高達48.3 Kb,最長Reads更是高達1.29 Mb!這為后期不用組裝,直接檢測定位區間內的變異提供可能。

??加速基因克隆的方法3-突變體創造

目前,研究單個基因和單個基因效應常用方法有誘導突變,DNA誘變劑包括物理誘變與化學誘變。跳躍基因,T-DNA的發現也為創造突變體提供新的方法。而人工誘變相較于自然突變有如下優點:1、變異豐富,原則上可在基因的任何部位發生突變;2、單基因隱性突變體可直接研究表型與基因型的關系,從而排除背景基因對其影響;3、絕大多數誘變植物與未處理植物之間的表型變化由誘變基因控制。

TILLING,即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(定向誘導基因組局部突變技術),是由Steven Henikoff領導的研究小組發展起來的,TILLING技術借助高通量的檢測手段,快速有效地從由化學誘變劑(EMS)誘變過的突變群體中鑒定出點突變。目前此技術廣泛應用于作物研究中,另外還有基因全基因組重測序的MutMap和MutMap +方法,實現功能基因的快速定位。MutRenSeq和MutChromSeq也應用于突變基因定位,2016年John Innes Centre組織利用EMS誘變產生的小麥突變體,使用液相捕獲技術,通過特異性的RNA捕獲探針對目標區域進行富集,二代測序后,通過比對野生型和抗性突變體的序列,找到了目標抗性基因。MutChromSeq在此基礎上進行改進,利用流式細胞儀技術將含目標基因的單條染色體分離出來,后期結合高通量測序,通過比較突變體及野生型的差異,快速克隆基因,此方法大大降低重測序的難度,減少了其它染色體序列對目標序列的影響。

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