【大豆灰斑病】基因組測序揭示尾孢霉在大豆中的潛在致病機制

題目:Genome sequencing and comparativegenomics reveal the?potential?pathogenic mechanism of Cercospora sojina Hara onsoybean
雜志名稱:DNA? RESEARCH
影響因子:5.415
合作單位:中國科學院等

 

研究背景

? ? ? 由Cercosporasojina?Hara引起的大豆灰斑病是世界上大多數大豆種植國家的常見大豆病。大豆灰斑病的致病因子是一種大豆破壞性病原體。控制這種疾病的主要措施是培育抗性大豆品種或施用化學殺菌劑,由于病原體的進化和基因突變,施用化學殺真菌劑通常在田間迅速失去作用。大豆灰斑病導致大豆產量降低。因此,獲取Cercospora sojina?Hara基因組的信息對研究大豆的感染機制及提高大豆產量等尤為重要。
? ? ??在本研究通過單分子實時測序技術組裝了C.sojina的高質量基因組序列。基因組大小為40.8Mb,編碼11,655個預測基因,通過RNA測序揭示8,474個基因。C.sojina基因組包含大量參與合成次級代謝產物的基因簇,包括真菌毒素和色素。然而,與其他植物致病真菌相比,在C.sojina基因組中鑒定出較少的碳水化合物及蛋白編碼基因。生物信息學分析顯示C.sojina含有約752個分泌蛋白,其中233個是效應子。在早期感染期間,代謝物生物合成和效應子的基因顯著富集,表明它們可能在致病性中起重要作用,揭示了尾孢霉(Cercosporasojina?Har)對大豆的潛在致病機制。

材料方法

1、試驗菌株:
C.sojina侵染的大豆幼苗中分離出真菌單孢子。將分離的孢子在28℃下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上生長。

2、基因組測序和組裝:
二代(Illumina),270bp文庫,90 x +?三代(PacBio)10kb文庫,123x

3、基因組注釋:
將所有預測的基因用數據庫進行功能注釋,數據庫為:Swiss-Prot、NR、KEGG、COG、Pfam、HMMER、GO、PHIbase。

4、重復序列和全基因組DNA甲基化分析
使用TandemRepeats Finder(TrF)鑒定串聯重復序列。使用三種軟件Repeat Modeler、Repeat Protein Masker和Repeat Masker嚴格挖掘轉座因子(TE)。

5、系統發育分析和共線性分析、碳水化合物活性成分的比較分析、次級代謝產物的提取和定量

6、轉錄組分析和定量RT-PCR:

7、推定效應子的功能研究
將推定的效應基因克隆到由35S啟動子驅動的二元載體pMD-1中。通過電穿孔將構建好的載體轉化到根癌土壤桿菌菌株EHA105中。使用含有指示效應物的EHA105菌株滲入4周齡本塞姆氏煙草葉無針注射器。GFP和Phytophothorasojae效應子Avr1b分別作為陰性對照和陽性對照。二十四小時后,用EHA105滲透植物攜帶pVX-BAX。

研究結果

1、C. sojina基因組的組裝

像大多數真菌一樣,C. sojina表現出類似的感染周期,但它也表現出一些區別(圖S1)。它不形成附著物,但分枝菌絲能通過開放氣孔感染植物(圖S1C和D)。與其他半營養真菌相比,FLS疾病發展相對較慢(圖S1C)。Kmer峰圖顯示該菌為單核真菌。(圖S2)

使用CANU從頭組裝測序數據(4,920,479,113bp clean reas),N50長度為1.59Mb,總組裝大小約為40.84Mb(表1)。通過circos-plot顯示了24個最大的支架(圖1)。預測共11,655個蛋白質編碼基因,其基因密度為每1 Mb約285個基因。在基因組中預測了277個tRNA和281個假基因。RNA-seq數據顯示有8,474個推定的蛋白質編碼基因。

Figure1. Circos-plotof?C. sojina.

2、重復序列和潛在的甲基化位點

重復DNA序列和TEs在真菌的進化,基因組結構和基因功能中起重要作用。在C.sojina基因組中鑒定了總共11,138,239bp(11M)重復序列,包括DNA轉座子,LTR反轉錄轉座子,串聯重復序列和其他未分類的轉座子(圖2A)。重復序列占基因組的25.56%。大多數重復序列(96.36%)是TE,而串聯重復序列僅占0.93%。DNA轉座子和LTR反轉錄轉座子分別占所有TE的28%和25%。

DNA甲基化涉及許多重要的細胞過程,例如基因組印記和基因轉錄調控。雖然已經在高等植物和動物中發現DNA甲基化多年,但最近在一些真菌中也有相關報道。使用SMRT能夠檢測到m6A和m4C甲基化。在C.sojina基因組中共鑒定了1,015,733m4C(4-甲基?-胞嘧啶)和17,409m6A(6-甲基?-腺苷)(圖2B)。大多數分類的DNA甲基化是m4C,占98.3%,而m6A僅占1.7%。然而,與m6A相比,m4CDNA甲基化在重復元件的區域中出現低頻率較低(圖2C-E)。

Figure2. Repeatelements and DNA methylation sites of?C.sojina.

3、比較基因組分析

利用一組真菌的系統發育骨架基因分析了C. sojina和其他真菌物種的進化關系。系統發育分析表明C. sojina在進化上接近于尾孢菌(Cercospora zeae-maydis),一種可引起玉米葉斑病的植物病原體(圖3A)。此外,C. sojina也接近其他三個病原體Pseudocercospora fijiensisSphaerulina musivaDothistroma septosporum(圖3A)。

Figure 3.Phylogenetic and synteny analysis of?C. sojina?with other fungal species.

4.分泌組織和潛在的效應器

? ? ? C. sojina的基因組包含11,655個蛋白質編碼基因,覆蓋約41%的基因組序列。最豐富的結構域是PF14295.4(n = 6),其介導蛋白質?–?蛋白質相互作用。其他常見結構域包括abhydrolase域(PF12697.5,n5),水解酶域(PF12146.6,n = 5)和PAN域(PF00024.24,n = 5)。

5.通過全基因組轉錄分析上調致病相關基因

由于C.sojina對大豆的感染進展非常緩慢,難以收集足夠的樣本來檢查植物菌絲的基因表達。饑餓治療可以模仿感染期間病原體的生理學。因此,使用生長24和48小時的菌絲體,并通過RNA測序進行轉錄組分析;分別在饑餓處理后24小時和48小時鑒定出3,227和3,223個差異表達的基因(DEG)。四類DEG引起了我們的注意,這些基因注釋為參與PHI,分泌蛋白組,推定的碳水化合物活性酶(CAZymes)和次級代謝過程。

6.基因簇用于次級代謝物

尾孢菌(Cercosporasojina)基因組編碼16個非核糖體肽合成酶(NRPS),20?個PKS,18個脂肪酸合成酶,3個萜烯合酶,2?個geranylgeranyl二磷酸合成酶和1種萜類化合物環化酶。這些酶參與次級代謝產物的合成,包括霉菌毒素,色素和生物堿。在C. sojina基因組中鑒定了一個具有8個尾孢菌素生物合成基因的類似基因簇。(圖4A)。這八個基因顯示高氨基酸序列與煙草(C. nicotianae)尾孢菌素生物合成基因的相似性在相同的串聯順序中(圖4A)。此外,我們觀察到感染期間8種基因的轉錄增加(圖4B)。

Figure 4. Putative gene clusters forcercosporin biosynthesis in?C. sojina.

? ? ? 色素是成功入侵病原體的另一組次要代謝物。通常,病原體產生的色素能夠在感染期間保護病原體免受宿主氧化應激。C.sojina基因組編碼多個推定的PKS,其負責色素產生(圖5A)。C.sojina可產生一些灰色色素,并且通過饑餓和cAMP處理顯著誘導色素(圖5B),表明色素可能與病原體毒力有關。因此,進一步分離和部分純化了色素。得到灰色,淺黃色和深灰色三種色素,深灰色是最豐富的色素。

Figure 5. PutativePKS gene clusters for pigment production in?C.sojina.

7.碳水化合物活性酶

成熟的植物致病真菌可以分解并利用CAZymes的植物細胞壁多糖。尾孢菌(Cercospora sojina)含有596個預測的CAZymes。與其他真菌相比,C.sojina具有更大的潛在碳水化合物酯酶組,其可催化取代糖的N-去酰化。在C. sojina基因組中,有大約23.5%的潛在分泌蛋白被預測為CAZyme,證明C.sojina可能在入侵期間使用大量CAZymes來消化宿主細胞壁。有趣的是,其中一個CAZymes家族,即糖苷水解酶GH109家族,是高度富集的(圖6)。

Figure 6. Comparison of carbohydrateenzymes between?C. sojina?and nine other fungal species.

8.推定效應子的功能分析

效應器是由細菌,卵菌或真菌分泌的低分子量蛋白質,其損害宿主免疫防御并適應特定環境。在玉米病原體U.maydis中,觀察到分泌的蛋白質編碼基因簇中的大多數基因在感染組織中同時被誘導。233個推定效應子的系統發育分析顯示,21個預測的效應子被分組成在C.sojina中含有2或3個高序列相似性基因的簇(圖7A)。假定的效應子群集也表明局部重復可能參與了C.sojina中效應子的擴增。另外,40個推定的效應器可以通過PHI數據庫注釋,并且大多數注釋的效應子與真菌發病機理有關。

因此,我們嘗試研究效應器功能。促凋亡小鼠蛋白BAX誘導的本氏煙草程序性細胞死亡(PCD)在生理上可能與病原體引起的防御相關的過敏反應相似,提供了有價值的篩查可以抑制與防御相關的PCD的效應物的方法。我們隨機選擇50個效應子并在本塞姆氏煙草中瞬時表達它們以篩選可以抑制BAX觸發的PCD(BT-PCD)的潛在效應物。結果表明,約1/4選擇的效應子強烈抑制BT-PCD(圖7B)。此外,qRT-PCR結果顯示,大多數這些推定的效應子在C.sojina感染后48小時被轉錄誘導(圖7C),這意味著它們可能有助于大豆灰斑病的早期感染。

結論

本研究通過SMRT測序技術組裝了C. sojina的完整基因組序列。這種測序技術不僅有助于我們找到重復序列,還有助于發現真菌中的DNA甲基化。通過基因組組裝和注釋,預測特定的CAZymes,次級代謝產物和效應子可以幫助C. sojina成功的適應大豆。同時,本研究也為這一重要的大豆灰斑病未來防治及發展奠定了基礎。

參考文獻:
Luo X ,Cao J , Huang J , et al. Genome sequencing and comparative genomics reveal thepotential pathogenic mechanism of Cercospora sojina Hara on soybean[J]. DnaResearch, 2018, 25(1):25-37.

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