ONT甲基化測序研究重磅來襲!!

DNA甲基化是表觀遺傳的經典修飾方式,其并不改變基因的堿基序列,而是通過改變基因的表達影響細胞的功能,在調控基因表達、維持染色質結構、基因印記、X染色體失活以及胚胎發育等生物學過程中發揮著重大的作用。DNA 甲基化的形式多種多樣,主要包括 C5-甲基胞嘧啶(5mC)、N6-甲基腺嘌呤(6mA)等。

目前市場常用重亞硫酸鹽法檢測5mC,其精確度高,但化學處理會導致DNA分子的片段化、測序深度高、無法鑒定更多修飾類型。Nanopore技術作為新一代基于納米孔的單分子實時電信號測序技術,截至目前,全球范圍內基于Nanopore平臺進行的甲基化研究文章近10篇,見刊于nature methodsbioRxiv等國際知名期刊。

ONT甲基化測序流程

不同于傳統的甲基化檢測方法,使用ONT平臺進行測序前,不需要再對DNA樣本進行化學處理,避免了人為因素和化學因素的影響。具體步驟如下:

1、提取高質量基因組 DNA,利用Nanodrop、Qubit 和35% 瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度和完整性質檢;

2、將基因組DNA打斷成平均8kb左右;

3、使用SQK-LSK109連接試劑盒(ONT官方試劑)進行文庫構建,包括DNA 損傷修復和末端修復、接頭連接、磁珠純化等;

4、使用Qubit 進行文庫定量。

? ? ? ? 圖1 甲基化建庫流程? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2 ONT 電信號識別

待文庫構建完成后,就可進行上機測序。 ONT 測序是新一代基于納米孔的單分子實時電信號測序技術,由于 DNA 鏈上不同堿基化學性質存在差異,所以當單個堿基通過納米孔通道時,會產生不同的電信號,而當存在堿基修飾時,同一位置的電信號也會有所差別。基于此,軟件則將這些電信號進行識別,判讀為不同的修飾信息。

ONT甲基化的優勢?

?單堿基水平檢測,無中間處理,不擴增、不富集,真實還原堿基修飾信息

?測序讀長長,避免短讀長帶來的拼接比對錯誤,鑒定準確

?鑒定種類豐富,5mC、6mA多種堿基修飾一次搞定,性價比高

?可進行等位基因特異性甲基化檢測

?ONT 甲基化成功案例

使用ONT平臺進行甲基化研究可謂日漸火熱,截至目前,已經有十多篇文章發表,研究學者的熱情日益高漲。百邁客將目前見刊的文章給大家進行了匯總,方便查閱

自從2017年開啟第一個ONT平臺研發立項,百邁客不斷探索與前進,經過一年多時間的沉淀與磨礪,百邁客Nanopore測序技術已經逐步成熟并且達到穩定狀態。截至目前,百邁客已擁有3臺ONT最高通量測序儀PromethION,并建立超過上百種物種類型的文庫,擁有大量的項目經驗!無論是技術還是項目經驗上,都實力過硬!

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