葉霉病| 重測序BSA+KASP策略定位番茄抗病基因Cf-10

題目:Molecular mapping of the Cf-10?gene by combining SNP/InDel-index and linkage analysis in tomato (Solanum lycopersicum)
發表時間:2019年1月8日
期刊:SCI期刊《BMC Plant Biology》

葉霉病,一種由番茄葉霉病菌引起的番茄病害,嚴重威脅著全球番茄的生產,并導致每年數百萬美元的經濟損失;然而,番茄葉霉病菌抗性基因定位結合MAS策略是改良番茄抗病能力的一條有效途徑。截至目前,利用不同的遺傳材料已經定位到許多番茄葉霉病菌基因或QTLs,但對于Cf-10基因定位的研究未見報道。

而本研究便集中于考察Cf-10抗病性的遺傳基礎,即運用一種新的組合分析策略(重測序BSA:SNP-index與InDel-index共定位,結合KASP分型精細定位,圖1.)快速定位抗病基因Cf-10。首先,根據F1,F2與BC1F1抗/感病表型證明番茄葉霉病菌抗性受顯性單基因控制;通過對F2群體的抗/感病池重測序,并聯合運用SNP-index與InDel-index的分析方法將Cf-10共定位在Chr 1.上的3.29Mb區間。接著,利用在此區間開發出的KASP標記進行精細定位。隨后,Cf-10的定位區間縮短到790 kb,其中只有一個候選基因Solyc01g007130.3,此基因注釋為一個含有LRR基序的受體蛋白激酶。最后,通過RT-qPCR分析進一步驗證Solyc01g007130.3為Cf-10候選基因。

圖1.?快速精細定位基因新的組合策略

研究結果

為考察Cf-10的遺傳基礎,作者對品種Ontario 792,Moneymaker及其F1,F2與BC1F1群體的抗病能力進行評估。結果顯示,品種Moneymaker對10種病菌生理小種表現敏感,而Ontario792均表現顯著抗病能力,暗示Ontario792對番茄葉霉病菌具有廣譜抗病能力;所有F1代個體均表現抗病,F2代抗病與感病個體呈現3:1分離比,暗示Cf-10受顯性單基因控制,并且BC1F1的表型分離比驗證了這一結果(圖2.)。

圖2.?番茄葉片表型及其分離模式

? ? ? 為定位抗病基因Cf-10,作者采用BSA重測序結合SNP-index與InDel-index分析的方法進行共定位。通過對雙親及2個極端混池高通量測序并分析發現4個樣品間共有159,740個SNPs與74,988個InDels(圖3.A與B)。接著,利用SNP-index與InDel-index兩種方法定位Cf-10抗病QTLs,如圖3(C與D)所示,僅定位到1個QTL,并且這兩種關聯算法均將這個QTL錨定在Chr.1;不同的是,SNP-index定位區間為3.35Mb,而InDel-index為3.74Mb,二者共定位區間限定在3.29Mb。其中共有408個注釋基因,包括73個非同義基因,16個移碼基因與16個包含eLRR domain的基因。

圖3. SNP/InDel統計及BSA分析. A. SNP統計;B. InDel統計;C. SNP-index分析;D. InDel-index分析

? ? ? 由于3.29Mb區間仍包含大量基因,作者進一步開發出16個KASP標記,其中5個有效的KASP標記用于147個單株(141個來自F2,6個來自F1,Ontario792?與Moneymaker)的基因分型。對Ontario792,Moneymaker與F1群體的KASP分型結果與測序結果一致,暗示測序結果與KASP分型是可靠的。接著,利用遺傳圖譜及KASP標記將定位區間鎖定在SNP1與SNP2之間(790kb,圖4.)。幸運的是,這個區間只有一個注釋基因Solyc01g007130.3,編碼受體蛋白激酶TMK1,其中含有一個LRR基序,這是抗病基因的一般特征,暗示Solyc01g007130.3是Cf-10抗病候選基因。然而,基于重測序數據在兩親本間并沒有發現Solyc01g007130.3中存在SNPs或InDels,進一步利用Sanger測序也沒有發現序列間差異。盡管如此,這并不能排除親本間存在甲基化修飾的差異,并且此基因上游啟動子等調控序列可能也存在著變異。

圖4. SNP/InDel結合KASP標記定位基因Cf-10

? ? ? 因此,為了進一步驗證上述定位結果,作者又通過RT-qPCR分析檢測候選基因Solyc01g007130.3在受病菌侵染的兩親本間的表達量差異,結果顯示,在抗病品種中此基因的表達量顯著高于感病品種,而在未感病時表達量并無明顯差異(圖5.)。結合以上結果,可以得出結論:基因Solyc01g007130.3就是Cf-10可能的抗病候選基因。

圖5. RT-qPCR分析候選基因Solyc01g007130.3的表達量(病菌侵染后)

研究結論

? ? ? 本研究采取一種新的組合策略(圖1.),即兩步信息分析SNP-index與InDel-index共定位,結合KASP標記分型精細定位,快速定位到特定性狀候選基因,為克隆Cf-10基因以及分子標記輔助育種提供一條強力有效的途徑。

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參考文獻:

Liu G, Zhao T, You X, Jiang J, Li J, Xu X. Molecular mapping of the Cf-10 gene by combining SNP/InDel-index and linkage analysis in tomato (Solanum lycopersicum). BMC Plant Biol. 2019 Jan 8;19(1):15.

 

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