Nature Microbiology | 炎癥性腸病的腸道菌群結構與代謝活性

中文題目:炎癥性腸病(IBD)患者的腸道菌群結構與代謝活性

影響因子:14.2

發表時間:2018.12

研究單位:麻省理工學院 哈佛大學

背景介紹

 

炎癥性腸病(IBD)是一種由腸道微生物與腸道免疫系統相互作用異常而引發的慢性胃腸道炎癥。IBD包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)兩種主要亞型,它們分別分布于大腸和小腸,且擁有各自獨特的微生物特征。研究表明,IBD患者的腸道微生物發生了巨大變化,與此同時,腸道微生物的代謝產物也能通過信號、免疫以及抗生素活性的途徑改變結腸環境。然而,腸道特異微生物與它們的分子產物如何通過相互作用來觸發、維持、減緩或預測IBD等炎癥狀況,我們目前仍不清楚。

短鏈脂肪酸(SCFAs)(如丁酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽)是腸道微生物分解膳食纖維產生的小分子化合物,它能通過調節組蛋白去乙酰化酶抑制活性、基因表達、細胞增殖和免疫應答來影響宿主細胞。研究表明,IBD患者糞便中的丁酸鹽含量降低,而丁酸鹽可以通過調節Treg細胞的產生和增強巨噬細胞的活性預防結腸炎。共生微生物可以通過修飾代謝物改變宿主產生的信號分子。研究表明,腸道微生物產生的色氨酸脫氫酶能夠將飲食中的色氨酸轉化為色胺和其他分子。在CD患者的腸道微生物中,色氨酸代謝基因有所下降;缺失IBD易感基因(CARD)動物的微生物色氨酸代謝發生了改變,導致宿主更易患結腸炎。

腸道微生物的16S擴增子測序與代謝組學研究表明,IBD患者的代謝物發生了變化且菌群多樣性普遍低于健康人群,與兒科IBD相關的腸道菌群也與代謝類型高度相關,糞便菌群結構與非靶向代謝組的相關性比靶向代謝組高。總之,腸道代謝組中存在與炎癥和IBD相關的特征不明代謝物,這些代謝產物可能是由微生物衍生或修飾,非靶向模式為未知代謝物的捕獲提供了可能。

本研究采用非靶向的液相色譜串聯質譜(LC-MS)技術和宏基因組技術,研究了IBD患者糞便樣品中的代謝組份和微生物的結構與功能。

 

研究方法

 

1.? 樣本收集(糞便):①PRISM(麻省總院IBD前瞻注冊試驗):CD患者(68例),UC患者(53例),健康人群組(34例)(Fig. 1a);②LifeLines DEEP和NLIBD(荷蘭北部人群前瞻研究,用于人群疾病的驗證):CD患者(20例),UC患者(23例),荷蘭北部健康人群(22例)(圖1.a)。

2. 宏基因組學:①DNA提取試劑盒:QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN);②宏基因組建庫測序:Illumina Hiseq 2500,2.5G數據/樣品;③物種鑒定與功能注釋:MetaPhlAn2,HUMAnN2。

3. 代謝組學:4種LC-MS模式。

●?質譜正離子模式(極性代謝物,如:有機酸):10μl勻漿,90μl萃取液(乙腈/甲醇/甲酸74.9:24.9:0.2,v/v)),內標(L-纈氨酸-d8和L-苯丙氨酸-d8),二氧化硅HILIC色譜柱(Waters)(150×2mm),流動相A(甲氨酸(10mM)和甲酸(0.1%)),流動相B(乙腈和甲酸(0.1%)),250μl /min流速,梯度洗脫(5%流動相A 保持1min,10min時提升至40%),全掃描分析模式(m/z:70-800,分辨率70000,獲取速率3Hz),質譜參數(離子噴霧電壓3.5kV,毛細管溫度350℃,探頭溫度300℃,鞘氣40,輔助氣15,S-lens RF 40)。

●?質譜負離子模式(極性代謝物):30μl勻漿,120μl萃取液(80%甲醇),內標(肌苷15N4、胸腺嘧啶-D4和甘膽酸鹽D4),Luna NH2色譜柱(Phenomenex),流動相A(乙酸銨(20mM)、銨水(20mM)),流動相B(氨水(10mM)/乙腈/甲醇(75/25),v/v),梯度洗脫(10%流動相A,至10min時至100%流動相A),全掃描分析模式(m/z:60-750,其余參數同上),質譜參數(探頭溫度325℃,鞘氣55,其余參數同上)。

●?質譜負離子模式(中極性代謝物,如:膽酸、自由脂肪酸):30μl勻漿,90μl萃取液(甲醇),內標(E2-d4),10μl進樣量,HSS T3色譜柱(Waters),流動相A(0.1%甲酸,水),流動相B(0.1%甲酸,乙腈),400μl /min流速,梯度洗脫(25%流動相A保存1min,至11min時至100%流動相B),全掃描分析模式(m/z:200-550,其余參數同上),質譜參數(探頭溫度300℃,毛細管溫度320℃,鞘氣45,輔助氣10,S-lens RF 60)。

●?極性和非極性脂肪酸:10μl勻漿,190μl萃取液(異丙醇),內標(1-十二烷基-十三酰-丙三醇-3膽堿磷酸),10μl進樣量,BEH C8色譜柱(Waters),流動相A(醋酸銨(10mM)/甲醇/甲酸95:5:0.1,v/v/v),流動相B(甲醇/乙酸99.9:0.1,v/v),450μl /min流速,梯度洗脫(80%流動相A保存1min,至2min時至80%流動相B,至7min時至100%流動相B并保持至10min),全掃描分析模式(m/z:200-1100,其余參數同上),質譜參數(探頭溫度300℃,毛細管溫度300℃,鞘氣50,輔助氣15,S-lens RF 60)。

(圖1.a:樣本來源、類型及分析方法)

研究結果

 

1.? IBD患者的代謝組變化與炎癥有關

本研究從155例(PRISM)樣本中共檢測出8,000多種代謝物,這些代謝物在健康人群與CD患者之間差異較大,UC患者的代謝物與健康人群和CD患者均有一定程度相似(圖1.b)。糞便樣品中的鈣保護素與代謝物、菌群結構變化的第一主軸(PCoA)相關性均較強(圖1.d.1e),UC患者的炎癥程度既與健康人群相似又與CD患者相似,表明UC患者之間的腸道菌群結構與代謝組份差異較大。

(圖1.b-e:IBD與個體腸道微生物和代謝物的關聯性)

(圖2:IBD代謝物豐度熱圖,圖中顯示了2729種IBD(UC/CD)與健康組之間具有豐度差異的特征代謝物)

2.? IBD患者腸道代謝物的比較分析

本研究采用Benjamini-Hochberg FDR(q<0.05)方法進行多重檢驗校正,在IBD患者檢測2729種豐度顯著差異的代謝物,其中1931種在IBD患者中顯著減少,224種在IBD患者中的顯著增多,505種在CD患者中明顯升高,僅69種只在UC患者中明顯增多(與圖1.b坐標軸中顯示的結果一致)(圖2)。基于HMDB注釋定義了代謝物類并重點研究了97類,其中8類顯著富集于CD患者,鞘脂類、甲亞胺酸和膽汁酸影響最大(圖3.a);7類顯著富集于UC患者,苯乙酸酯含量略有升高(圖3.b)。IBD患者富集的膽酸包括膽酯(q=0.003)和鵝脫氧膽酸鹽(q=0.0002)(圖3.c),CD患者的次生膽汁酸(膽酸鈉和脫氧膽酸)發生了補充消耗(q=0.06,0.13),鞘磷脂和神經酰胺在CD患者和UC患者中均明顯過多(q<0.02)。多數代謝物類在IBD患者(CD和UC)中顯著減少(圖3.a.3.b),它們包括三萜、長鏈脂肪酸、苯基苯并二惡烷、膽固醇和三酰基甘油(C54:6)(圖3.e.3.f)。另外,乳酸酯和泛酸酯(分子類無顯著差異)在IBD患者中分別顯著富集和減少(圖3.g.3.h)。

(圖3. IBD患者和健康人群的腸道代謝物富集比較)

3.? IBD患者的腸道代謝物模型

為了探究IBD患者腸道代謝物的生物模式,本文采用線性模型方法對2729種差異代謝物進行相似性聚類分析。結果表明,IBD患者“最大代謝物聚類簇”包含39種代謝產物,該聚類簇包含12種膽酸(推測)、17種未標記的代謝物、膽酯(圖4.a淺綠色三角形)以及鵝脫氧膽酸酯(圖4.a 深綠色三角形);健康人群的“最大代謝物聚類簇”包含62種高豐度代謝分子,四吡咯和衍生物均顯著富集(圖4.b)。

(圖4. 基于豐度相關性的IBD患者代謝物聚類。FC,糞便鈣防御蛋白)

4.? IBD患者腸道菌群的“種”水平變化

基于Bray-Curtis算法的距離矩陣(PCoA)發現,CD患者與健康人群腸道菌群結構差異較大,而UC患者與前兩者之間并無明顯的區別,UC患者組內分布也較零散(圖1.c.1.e)。為了進一步探究,本文運用線性建模研究195個“種”水平微生物。在IBD患者與健康人群之間發現了50種差異豐度微生物,其中35種在IBD患者中豐度較高,Roseburia hominis、Dorea formicigenerans和Ruminococcus obeum在健康人群中富集最多。與很多IBD研究報道一致,IBD患者的微生物種類明顯減少,多樣性普遍降低。“種”水平未分類的Roseburia(氏菌屬)在UC和CD患者中顯著富集,Bifidobacterium breve和Clostridium symbiosum僅富集于UC患者,CD患者具有20種獨特且豐富的菌(如R. gnavus、Escherichia coli和Clostridium clostridioforme)(圖5)。

(圖5. IBD患者“種”水平的菌群結構)

5.? IBD相關微生物與代謝物的關聯機制

微生物與代謝物之間的正相關性反映了兩者之間的協同效應,為了確定這種關系,本研究對具有代表性的差異豐度菌種和代謝物進行關聯分析(線性模型),發現了15,679例FDR(q<0.05)關聯,其中乳酸與Pediococcus acidilactici呈正相關(r= 0.23,Spearman)。經過嚴格篩選,最終得到2279例關聯(圖6),其中包括122例標準和特征菌“種”的關聯(圖7.a),901個代謝物聚類簇,1878個豐度差異代謝物。然而,這些關聯僅有6%是具有統計學意義且在對照組(健康人群)中被證實的。ETA(廿碳三烯酸)和DPA(二十二碳五烯酸,與CD相關的代謝物)與對照組相關的菌種呈負相關(Eubacterium ventriosum),與IBD相關的菌種呈正相關(R. gnavus)(圖7.b.7.c)。CA(辛酸)對照組中高度關聯的厭氧菌(Alistipes shahii、Alistipes putredinis和Alistipes finegoldii)正相關,與R. gnavus顯著負相關(圖7.d)。

(圖6.)

(圖7. IBD相關微生物和代謝物的潛在關聯)

6.? IBD代謝相關微生物的功能

基于線性模型分析IBD微生物組的酶功能(EM)。與對照組相比,568種酶的豐度在UC或CD患者中差異顯著(FDR,q<0.05)(圖8.),其中246種酶不受任何單一菌種支配。UC和CD患者均富集有鎂離子轉運ATP酶(EC 3.6.3.2)(圖9.a)和乙醇胺氨裂合酶(EC 4.3.1.7)(相對于對照組)(圖9.b),而乙醇胺氨裂合酶與甘油磷脂的合成有關,后者在UC和CD患者的代謝物中富集最多(圖3.a)。谷胱甘肽還原酶(EC 1.8.1.7)在IBD患者中也有較高豐度(圖9.c);丙酮酸合成酶(EC 1.2.7.1)在對照組中富集,在CD患者中完全未檢測到(圖9.d);維生素B12(如前咕啉,EC 1.3.1.76)在對照組含量較高(圖9.e)。四吡咯可能是維生素B12的衍生物和相關化合物,它在LC-MS代謝組分析中普遍存在,并且在IBD患者中富集(圖4.b)。

“代謝組-基因功能(酶)”關聯模型遵循“菌種-基因功能(酶)”關聯,多數代謝物僅與少數基因功能(酶)存在小部分(3%)關聯(反之亦然),而多數(95%)“代謝組-基因功能(酶)”關聯與IBD的發病機理有關。這些小部分“代謝組-基因功能(酶)”關聯中,鎂離子轉運ATP酶與羥基十四烷酸顯著負相關(r=-0.492,Spearman)(圖9.f),precorrin-2脫氫酶與正已酸正相關(r=0.507)(圖9.g)。

(圖8.)

(圖9. IBD代謝相關微生物的功能)

7.? Multi-omic特征區分群組中IBD子集

最后,本研究從代謝物、微生物菌“種”及兩者組合水平訓練“隨機森林”(RF)分類器,鑒定IBD病癥和IBD子集,受試者工作曲線(ROC)描繪RF分類器的假陽性率和準確率,混合矩陣評估PRISM隊列IBD子集RF分類器。結果顯示,所有RF分類器對IBD患者和健康人群的辨識效果良好,AUC值為0.86-0.92,交叉驗證結果(AUC:0.90-0.92)更優于獨立驗證結果(AUC:0.86-0.89)(圖10.a)。PRISM隊列中,代謝物、微生物菌“種”及兩者組合水平預測UC、CD和健康人群的準確率為64-65%,該結果雖然不如案例/對照成功,但仍高于隨機預測(正確率:30%)(圖10.b),將PRISM訓練IBD子集RF分類器應用于荷蘭人群時(用于人類疾病驗證),輸入數據類型之間差異較大(圖10.b)。

(圖10.腸道微生物Multi-Omics analysis預測IBD病癥及子集)

下載英文文獻全文

===其他相關研究(代謝組學+宏基因組學)===

1. 嬰兒腸道微生物在發育和Ⅰ型糖尿病發展中的動態變化

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2. 二甲雙胍改變了治療初期Ⅰ型糖尿病患者的腸道微生物,促進了該藥的療效

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3. 藥物治療對心血管疾病模型(apo-E?/?)小鼠腸道微生物和代謝物的影響

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