單細胞轉錄組測序10× Genomics技術及優缺點

小編之前已經跟大家簡單介紹過了單細胞轉錄組測序的一些相關知識,并提到了在單細胞轉錄組前期,主要依賴三種方法:SMART-seq2技術、10×genomics技術及Andeplete技術。? 現在就跟大家詳細介紹一下其中10×genomics單細胞轉錄組測序技術以及單細胞轉錄組測序優缺點。

 

10x Genomics單細胞技術

 

ChromiumTM Single Cell 3′ Solution是基于10 X Genomics平臺,能夠一次性分離、并標記500–10000個單細胞,并能在單細胞水平進行檢測的技術,其通過微流控系統,將單細胞或長片段DNA分子快速分配到油包水的微反應體系中,每個微反應體系中的單DNA分子會獲得唯一的特異性分子標簽,制備生成的測序文庫可以在illumina平臺進行測序,并由10x Genomics提供數據分析及可視化軟件,測序實驗及分析流程可以和illumina系統無縫銜接。該平臺廣泛應用于3’單細胞轉錄組測序、基因組組裝應用、免疫組庫測序、ATAC-seq、人全基因組及全外顯子組測序。

10x Genomics單細胞轉錄組測序有效地解決了組織樣本無法破解的細胞異質性難題,有助于發現新的細胞類型;并基于大量的單細胞基因表達數據,可以提供細胞表達特征聚類、亞群表達特征的分析、標志物篩選等方面的分析,是一種高效的單細胞基因表達水平檢測技術。

 

10x Genomics單細胞轉錄組測序優缺點

 

10x Genomics單細胞轉錄組測序優點

1、簡單便捷:集單細胞分選、擴增、建庫于一體;
2、細胞通量高:每個樣本細胞數可達500-10000個;
3、建庫周期短:1天可完成細胞懸液制備、單細胞捕獲、擴增及建庫;
4、超高捕獲效率:單細胞捕獲效率高達65%;
5、真正意義的單細胞:單個液滴捕獲到多個細胞的概率極低(0.9%/1000cells);
6、價格實惠:相較于其它單細胞平臺,價格實惠。

10x Genomics單細胞轉錄組測序缺點

1、非全長信息:只能獲得3’端轉錄本信息;
2、樣本要求高:單個樣本細胞起始量達10^5-10^6個,活細胞數目需超過80%,建議在90%以上最佳。
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10x Genomics單細胞轉錄組測序流程

 

單細胞懸浮液制備

細胞質檢

10 X genomics 標記

cDNA 片段化

文庫構建

Illumina 測序

數據分析

單細胞樣本檢測

將樣本制成單細胞懸浮液,用Countess? II Automated Cell Counter 進行細胞計數和細胞活率測定,細胞活性高于80%,并將細胞濃度調整到理想濃度(1000個/μL)。

實驗流程

1)將制備好的單細胞懸浮液與含有barcode信息的凝膠珠以及酶的混合物結合,然后在微流體“雙十字”中進行液滴包裹,從而形成GEMs(Gel Bead-In-EMulsions),有效GEMs中包含膠珠(膠珠中有預制的10x引物)、單細胞、和Master Mix。然后,在GEMs內進行細胞裂解和逆轉錄反應。有效GEMs中,10X Barcode將與cDNA產物連接在一起,接下來再將GEMs破碎并打碎油滴,以cDNA為模板進行PCR擴增,cDNA擴增完成以后,針對擴增產物進行質檢(擴增片段大小以及擴增產物的產量)。

2)擴增產物質檢合格以后,進行測序文庫的構建。首先利用化學方法將cDNA打斷成200-300bp 左右的片段,cDNA片段化、末端修復和加A,進行cDNA片段篩選,P7 Adaptor接頭連接并通過PCR擴增引入樣品Index,最后進行片段篩選從而得到cDNA文庫。

3)文庫完成以后進行庫檢,庫檢合格以后,利用Illumina測序平臺進行測序,獲得測序數據,并進行后續的數據分析。

 

10x Genomics 單細胞轉錄組測序應用方向

 

核心:細胞群體的劃分與細胞群體間差異表達基因的檢測

多種細胞類型:

組織類細胞、免疫細胞、血液細胞、癌組織細胞、神經類細胞等

?廣泛應用方向:

免疫方向

腫瘤方向

病理分型

干細胞方向

發育生物學:神經、腦、胚胎等

細胞圖譜繪制

……


10x Genomics作為單細胞領域的后起之秀,巧妙使用了Barcoding(條形碼)和Microfluidics(微流體)技術,在單細胞分離、擴增原理上具有明顯的優勢。為科研需要提供了高質量的技術支持,如果大家想要了解關于10x Genomics 單細胞技術的更多內容,可與我們公眾號聯系,隨時恭候您的大駕光臨哦~~~

 

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