J Hazard Mater丨全長轉錄組解析蜈蚣草砷超富集調控機制在植物修復中的潛在應用

2019年1月23日Journal of Hazardous Materials在線發表中國科學院植物研究所何振艷研究團隊“Potential use of the Pteris vittata arsenic hyperaccumulation-regulation network for phytoremediation”研究論文。本文通過三代全長轉錄組、二代轉錄組和蛋白組聯合分析,闡述了蜈蚣草砷超富集調控機制。

中文題目:蜈蚣草砷超富集調控機制在植物修復中的潛在應用
英文題目:Potential use of the Pteris vittata arsenic hyperaccumulation-regulation network for phytoremediation
發表期刊:Journal of Hazardous Materials
影響因子:6.434

研究背景

砷是一種自然界廣泛存在的有毒類金屬元素。隨著人類和科技的發展,農藥、采礦等行為對土壤造成了嚴重的砷污染。砷可通過食物鏈從土壤富集到人體中,對人體造成極大的傷害。為保護人類健康,維護糧食安全,亟需對土壤砷污染進行治理。近年來,以砷超富集植物蜈蚣草為基礎的植物修復技術,為砷污染土壤的修復提供了新的低成本和環境友好的治理策略。
蜈蚣草是一種砷超富集的模式作物,具有極強的砷抗性和富集能力。據統計,蜈蚣草地上部分砷富集量可達23 g/ kg,且不影響其正常生長,是價值極高的植物修復材料。目前,蜈蚣草組學信息的缺乏已成為其砷超富集機制研究的瓶頸,超富集過程關鍵分子元件的未知,極大的限制了植物修復技術的研發和推進。

研究材料及方法

研究材料:蜈蚣草孢子體收集于湖北武漢,并在無砷培養土中長至10cm左右。
研究方法:使用2 mM As(III) (NaAsO2)或2 mM As(V) (NaH2AsO4)作為試驗組進行水培處理,24h后分別采集根部和地上部進行測序。
測序平臺:北京百邁客生物科技有限公司Illumina及Pacbio測序平臺。

研究結果

1 構建蜈蚣草“全長轉錄組-液泡膜蛋白質組”數據庫
SR-uXRF掃描結果顯示,使用As(III)/As(V)處理24h后,蜈蚣草可迅速吸收并將砷積累到體內。本研究使用PacBio RS-II 測序平臺,構建1-2、2-3和3-6 Kb三個文庫共8個cell,其測序長度最長達50kb,平均長度3,111bp。使用Illumina 二代測序平臺共計獲得521M雙端reads,平均長度為924bp。通過蛋白質組學測序分析,共計獲得13,595個液泡膜肽段,可以匹配到轉錄組數據庫中的1,512個轉錄本。與NGS測序技術相比,使用Pacbio進行三代測序可獲得更為完整的轉錄本,得到的轉錄本數量少但平均長度更長。使用二代數據對三代數據進行校正后其轉錄本的質量從0.598提升至0.906。綜上所述,在使用As(III)/As(V)處理后,共計獲得 69,615轉錄本,381個lncRNAs,1,482個可變剪切及1,512個可匹配轉錄本的肽段。將以上信息進行整合,構建了蜈蚣草“全長轉錄組-液泡膜蛋白質組”數據庫。

圖1 不同處理下蜈蚣草砷累積水平及“全長轉錄組蛋白組”數據庫構建工作流程

2 As(III)/As(V)處理條件下蜈蚣草基因表達譜
對不同處理不同組織部位進行兩兩比較(CKS-As(III)S、CKR-As(V)S、CKS-As(III)R和CKRAs(V)R),共計獲得4,601個差異表達基因。通過K-means算法進行富集分析,6個cluster中的共2,997(65.1%)個DEGs在根和地上部出現相反的表達模式:其中k1、k3、k4和k6以地上部表達模式為主,其生物學功能包括光合作用等;而k2和k5以根部表達模式為主,參與ABC轉運等功能。
WGCNA組分分析可知,粉色和紫色模塊的地上部與As(III)處理顯著相關,根部模塊中綠色和紫色模塊與As(III)處理顯著相關,粉色模塊與As(V)處理的地上部顯著相關,棕色模塊與As(V)處理的根部顯著相關。通過KEGG富集分析發現,在所有的砷處理樣品中,均富集到GSH代謝(ko00480)和ABC轉運受體(ko02010)兩個通路。內質網蛋白質加工過程(ko04141)主要富集在砷處理的根部樣品中。因此,這些通路可能在蜈蚣草的砷超富集過程中扮演重要作用。

2 K-means聚類及WGCNA組分分析

3 蜈蚣草主要轉運蛋白家族的鑒定
本研究共鑒定到包括已知PvTIP4;1、PvACR3和PvACR3;1在內的共2,248個轉運受體基因,其中226個與砷脅迫相關。與砷相關的絕大多數轉運受體與6個高表達的基因家族有關,包括ACR3 superfamily、ABC superfamily、MFS superfamily、P-type ATPase、NRT3 superfamily和MIP superfamily。其中ACR3 superfamily和ABC superfamily基因家族基因在砷處理樣品中表達量上調,MFS superfamily基因家族基因在根部As(V)處理組和地上部As(III)處理組表達量上調,P-type ATPase基因家族在地上部As(III)處理組表達量上調,NRT3 superfamily基因家族在根部As(V)處理組表達量上調,而MIP superfamily基因家族在As(III)S和As(V)R中表達下調。以上結果表明這些轉運蛋白家族對砷的轉運起到重要作用。
通過使用全長轉錄本構建蛋白數據庫,對液泡膜蛋白進行重新注釋,共找到13,595液泡膜蛋白肽段,比對到1,512個轉錄本,其中鑒定到包括P-type ATPase、MIP、MFS、ABC、丙糖-磷酸鹽和賴氨酸-蘇氨酸轉運受體8等6個轉運家族在內的119個液泡膜轉運蛋白。其中有四個轉運蛋白家族表現出高表達水平且與砷處理應答有關:絕大多數的 MIP和P-type ATPase轉運蛋白有著更高的表達水平,而ABC和 MFS轉運蛋白則在砷刺激后在地上部或根部表達上調。以上結果表明這些轉運蛋白家族在液泡膜上對砷的超富集起到重要作用。

 

3?液泡膜潛在的砷轉運蛋白的鑒定及表達模式分析
4 蜈蚣草砷抗性通路的鑒定
本研究表明,錯誤折疊蛋白降解和GSH代謝途徑在砷處理相關模塊中富集,為蜈蚣草的砷抗性機制提供了新思路。
內質網蛋白加工通路(ERAD, ko04141)在所有與砷處理相關的模塊中顯著富集程度最高。重金屬會導致細胞內的蛋白錯誤折疊而引起內質網的應激。內質網蛋白降解通路(ERAD)和泛素蛋白酶體通路(UPP)可降解錯誤折疊蛋白的合成而維持細胞健康。在進行砷處理后,所有與內質網應激相關基因并未被激活,而參與ERAD和UPP通路的基因則表達量上調,且根部基因表達水平高于地上部。根部是直接與環境中的砷接觸部位,其錯誤蛋白降解能力的提高,可保證根部的正常代謝,進而賦予其較強的砷抗性。
GSH代謝通路也在所有的砷處理樣品中富集。在植物中,GSH可作為抗氧化劑阻止ROS損傷。在本研究中,GSH合成的兩個關鍵酶GSH1和GSH2并未明顯受到砷處理的影響,而GST轉錄本的表達量則在砷處理后顯著上調。GST可通過谷胱甘肽與亞砷酸鹽結合而介導砷-硫醇化合物的形成。蜈蚣草有著很強的砷-GSH絡合物的合成能力,但其絡合物量卻很少,因此有可能存在高效的“As(GSH)3絡合-區隔化-降解”過程。一旦As(GSH)3進入液泡而GST不足,由于砷-硫醇類化合物的高度不穩定性,可能發生不可逆降解,從而使得As(GSH)3含量很低。而蜈蚣草高效的‘砷絡合-區隔化’系統能阻止細胞質內的砷損害,進而增加蜈蚣草對砷的抗性。
圖4 ERAD通路和GSH代謝過程
5 蜈蚣草砷超積累調控相關非編碼RNA(lncRNA)及可變剪接鑒定
本研究共鑒定到1,482個可變剪接事件,并分為六類包括:內含子保留(RI)、外顯子跳躍(SE)、最后外顯子可變剪切(AL)。第一外顯子可變剪切(AF)、3’端可變剪接位點(A3)和5’端可變剪接(A5)。WGCNA分析結果共分為四個模塊(橙色、綠色、藍色,灰色)。在地上部,所有樣本都與橙色模塊相關,而在根部,綠色模塊與As(III)R顯著相關,藍色模塊與AS(V)R顯著相關。對不同模塊進行KEGG富集分析得知,內質網蛋白質加工通路和GSH代謝兩個最重要的通路,顯著富集在綠色模塊。通過PCR對相關可變剪切進行鑒定,結果表明可變剪切極大的豐富了轉錄本的數量,在錯誤折疊蛋白降解過程和GST的表達上起調控作用。
5??可變剪切的表達模式及功能分析
????此外,本研究還鑒定到381個不同長度的lncRNA。通過WGCNA進行lncRNA與靶基因間的共表達和相關性分析得知:來自AS(III)S處理組的lncRNAs及其靶基因主要與橙色模塊相關,CKS主要與綠色模塊相關,而來自根部的則與深灰色模塊相關。“谷胱甘肽結合”條目富集在深灰色模塊,表明蜈蚣草根系中的lncRNA可能參與了GSH結合的調控。通過qRT-PCR進行定量分析可知,根中與GST相關的lncRNA-mRNA表達水平呈正相關,表明lncRNA和其GST靶基因間存在調控作用從而保證根部的抗砷性。
6 lncRNAs的表達模式及功能分析

總結

 

????三代測序技術持續火熱,但是如何利用該技術解決相應的科學問題,需進行深入思考和嚴密的研究技術路線設計。本篇文章將三代轉錄組學技術與蛋白質組學結合,并不只停留于表面數據的羅列和概述,而是通過層層推進與數據的深度挖掘,圍繞關注點(砷超富集機制)進行多角度論證,對蜈蚣草砷超富集調控機制的闡明奠定了重要基礎,也為植物修復工程植株的培育提供了潛在的分子元件。

小編寄語

全長轉錄組測序利用Nanopore或Pacbio三代測序平臺進行的測序,可借助其超長讀長優勢,無需組裝,直接獲得全長轉錄本,準確鑒定基因的可變剪接、APA、融合基因、基因家族和非編碼RNA等信息。此外,全長轉錄組和蛋白組聯合分析是近兩年研究熱點,一方面可以構建蛋白搜索數據庫,全面準確地對蛋白進行鑒定和定量;另一方面對可變剪切事件進行相互驗證。
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百邁客自2015年率先引進PacBio三代測序平臺,20188月牛津納米孔公司與百邁客公司達成長期合作,擁有MinIONGridION X5PromethION三種型號全套納米孔測序儀。至今已積累了豐富的項目經驗,目前成功發表8篇全長轉錄組文獻,先后發表在《Plant Biotechnology Journal》、《Journal of Hazardous Materials》、《Scientific Reports》、《Fish & Shellfish Immunology》等國際知名期刊,是國內發表全長轉錄組成功案例最多的公司,已發表文章研究物種分別有楊樹、蜈蚣草、甘薯、野生甘薯、兔子、跳甲、花羔紅點鮭和辣椒,覆蓋領域分別為林木、哺乳動物、昆蟲、水產和作物等。

 

 

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