外泌體研究方法:機理研究or分子標志物研究

眾所周知,外泌體在很多生理病理上起著重要的作用,如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等;同時,外泌體與疾病診斷、預后等密切相關,因此也可以作為分子標志物;當然,外泌體經過一定修飾后,可作為載體將包裹在其內的藥物/貨物運送到特定靶標組織或區域。

下面我們來為大家分別介紹2篇近期發表的外泌體小RNA測序研究方法,一個方法是為機制機理研究方向,另一外泌體研究方法為分子標志物研究方向。

外泌體研究方法:【文獻一】

 

該研究由南京大學醫學院附屬鼓樓醫院的學者完成,題目:間充質基質細胞來源的外泌體通過miR-182調節巨噬細胞極化減弱心肌缺血再灌注損傷。

研究背景

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)逐漸成為調節心臟炎癥的有力候選者,MSCs分泌的外泌體可能是心肌梗死后MSCs移植起作用的新機制。作者探討了MSC來源外泌體(MSC-Exo)在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)后巨噬細胞免疫調節中的作用及其在心臟損傷修復中的意義。

主要研究方法

使用梯度離心法從MSC的上清液中分離外泌體(MSC-Exo);

在心肌缺血/再灌注(I/R)之前和之后24小時施用巨噬細胞清除劑-二氯亞甲基二膦酸鹽(Cl2MDP)脂質體,再灌注后0h立即遞送MSC-Exo或PBS在至心肌。檢測梗塞面積以及心臟和血清中的炎癥水平等;

流式細胞檢測分析巨噬細胞M1和M2比例;

MSC-Exo miRNA測序分析鑒定巨噬細胞極化的有效候選分子和其靶基因。

研究結果

在心肌I/R后通過心肌內注射給小鼠施用MSC-Exo減少了梗塞面積并減輕了心臟和血清中的炎癥水平;

用巨噬細胞清除劑-二氯亞甲基二膦酸鹽(Cl2MDP)脂質體消除了MSC-Exo的療效;

MSC-Exo在體內和體外均調節促炎的M1巨噬細胞向抗炎的M2巨噬細胞極化;

MSC-Exo-miRNA-seq揭示miR-182可能作為巨噬細胞極化的有效候選介質,以及其下游靶基因TLR4。敲低MSC-Exo中miR-182部分減弱其對巨噬細胞極化的調節,TLR4的敲低也賦予心肌I/R小鼠模型中的心臟保護功效并降低炎癥水平。

 

外泌體研究方法:【文獻二】

 

該研究由中央民族大學生命與環境科學學院/轉化神經科學研究中心負責人程勇教授領導課題組完成,題目:全基因組整合分析提示精神分裂癥外泌體來源的miRNA失調。

研究背景

精神分裂癥(schizophrenia,SCZ)風險相關的遺傳變異已經被廣泛研究了,但是SCZ相關的轉錄后機制尚未得到很好的研究。并且這些遺傳變異通常是微效的。除遺傳因素外,越來越多的證據表明表觀遺傳學可能參與SCZ的發病機制。已知的表觀遺傳標記中,microRNAs(miRNAs)在過去十年中備受關注,已被證明在神經發育和中樞神經系統的維持中發揮關鍵作用,例如神經分化、突觸可塑性和認知功能。以往的研究提示miRNA可作為各種神經精神疾病的潛在生物標志物。

方法和結果

1、miRNA篩選:

血清exo-miRNA-seq,49個第一次發作未用藥的SCZ患者?vs?46個HC對照;

1)training set:23個SCZ患者?vs?23個HC對照,鑒定高表達(TPM≥10)的、顯著差異表達(FDR<0.05)且差異倍數較高(FC≥2)DEmiRNAs:hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p和hsa-miR-133a-3p。

2)testing set:26個SCZ患者?vs?23個HC對照,鑒定高表達(TPM≥10)的、顯著差異表達(FDR<0.05)且差異倍數較高(FC≥2)DEmiRNAs共計7個,包括前面training set的3個DE miRNA。

3)pooled set:綜合上述2個set,共計6個miRNA符合上述條件:6 miRNAs (hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-184)。

2、隨機森林分類器鑒定SCZ診斷分子標志物:

使用training set鑒定到一組11個miRNA,其AUC(Area Under Curve)為0.94 (95% CI, 0.88–1.0),敏感性0.783,特異性0.957。

testing set中驗證該組11個miRNA的敏感性為0.769,特異性為0.783,AUC 為0.753 (95% CI,0.61–0.90)。

3、SCZ外泌體miRNA共表達模塊分析:

上述pooled set(49個SCZ患者?vs?46個HC對照)進行miRNA WGCNA分析,共計鑒定到11個共表達的模塊,其中3個與疾病狀態顯著相關。

4、DE miRNA以及SCZ相關miRNA共表達模塊靶基因通路和功能富集分析:

比如hsa-miR-206,其是SCZ患者的血液外泌體中最顯著上調的miRNA,并且之前報道其調節腦源性神經營養因子BDNF表達。顯著相關miRNA共表達模塊靶基因顯著富集到了O型聚糖的生物合成等通路,GO富集到了神經遞質轉運蛋白、樹突棘和樹突發育相關term。

4、qRT-PCR驗證DEmiRNA表達及其靶基因表達驗證:

qRT-PCR驗證:100個SCZ患者(57例第一次發作未用藥患者FEDF和43例長期治療患者CT)vs?100個對照對于hsa-miR-206、hsa-miR-144-3p其驗證結果與二代測序一致,且經過長期治療在CT組其水平會向正常組趨近。靶基因表達和elisa結果顯示SCZ患者血液中BDNF mRNA和蛋白質水平降低。greenyellow模塊中靶基因GALNT8和GALNT15也顯著降低。

文獻一:Zhao J, Li X, Hu J, et al. Mesenchymal Stromal Cell-Derived Exosomes Attenuate Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through miR-182-Regulated Macrophage Polarization[J]. Cardiovascular Research, 2019.

下載:鏈接: https://pan.baidu.com/s/1qficU6O8O-xpv8ZCrqMlnw 提取碼: 2nrh

文獻二:Du Y, Yu Y, Hu Y, et al. Genome-Wide, Integrative Analysis Implicates Exosome-Derived MicroRNA Dysregulation in Schizophrenia[J]. Schizophr Bull. 2019 Feb 16.

下載:鏈接: https://pan.baidu.com/s/1BIzQ76znwBRt_AemCaHC_A 提取碼: b6jy


 

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