做Hi-C準備樣本時,你應該注意這幾點

Hi-C是以整個細胞核為研究對象,利用高通量測序技術,結合生物信息分析方法,研究全基因組范圍內整個染色質DNA在空間位置上的關系,獲得高分辨率的染色質調控元件相互作用圖譜。Hi-C常與RNA-Seq等多組學技術進行聯合分析,從基因調控網絡和表觀遺傳網絡來闡述生物體性狀形成的相關機制。

小編此前給大家介紹過Hi-C技術的應用及與多組學技術搭配的案例解讀。在Hi-C技術的“硬件”條件鋪墊之后,執著于樣本制備階段的小編,要來普及一下“軟件”環節的注意事項了。

萬丈高樓平地起。再高超的技術,再前衛的應用方向,也要基于項目的樣本質量才能順利推進,樣本準備環節便是一個項目整體的奠基石。

做Hi-C所涉及的樣本通常有全血樣本,組織樣本以及細胞樣本。

血液樣本

送樣建議

血液采集后加入含EDTA或檸檬酸鈉抗凝管中(因肝素鈉抗凝會影響酶活性,故不建議用肝素鈉抗凝),輕輕顛倒十次混勻,室溫正立放置,平衡2h后立即送樣,并盡量確保24h內運輸至實驗室。

注意事項(防止污染、溶血)

a. 血液必須為新鮮血樣。

b. 取樣前要進行消毒處理:包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等,防止所取血液樣品被物種本身攜帶的細菌等污染物污染;

c. 準備檸檬酸鈉或EDTA抗凝管;

d. 依據抗凝管的實際規格采取全血樣品,比如:10 ml規格的抗凝管可以取樣10 ml;

e. 取完血后,迅速輕柔顛倒混勻全血樣品,保證血液與抗凝劑充分混勻;

f. 天氣較熱時:含有血液樣品的抗凝管運輸時使用冰袋低溫運輸,注意,冰袋不要與抗凝管直接接觸,以防止血液凍凝;天氣較冷時:含有血液樣品的抗凝管運輸時無需加冰袋運輸。

組織樣本

送樣建議

將肌肉表面附著的血液、脂肪、毛皮等非肌肉組織處理干凈,簡單梯度凍存(4℃ 30 min,,-20℃ 30 min,放于-80℃長期保存),干冰運輸。

注意事項(防止污染、溶血)

a. 凍存樣品注意—“慢凍快融”;

b. 保證組織樣品新鮮凍存,保存時間不要太長(以凍存時間1個月為宜)。

細胞樣本

送樣建議

需要進行甲醛交聯固定,細胞不可經過核酸染色步驟,交聯前處于活性狀態,冷凍細胞需活化后在進行交聯。建議培養到10^7個細胞用于固定,以保證試驗的可重復性。

交聯細胞步驟建議

1、細胞交聯

a. 取新鮮活細胞置于1.5 ml離心管中,加入1 ml的cold 1x PBS搖勻,1000 g、4℃離心2 min;

b. 吸棄上清,每管再次加入1 ml的cold 1xPBS輕混勻,1000 g、4℃離心2 min;

若不進行細胞裂解,則改成?b. 1 ml cold PBS 重懸沉淀,把重懸液轉移到凍存管,340-600 g、4℃離心 8 min 去上清。

注:做到此步可直接液氮速凍,干冰運輸,信息單中備注:“交聯完成,PBS清洗后,未進行細胞裂解”。

c.吸棄上清,用1 ml cold 1x PBS重懸沉淀,加入適量(57 ul)37%甲醛(終濃度2%)混勻,室溫放置10 min(1-2 min混勻一次);

d.加適量(71 ul)2 M的氨基乙酸(4℃保存)終止反應(終濃度0.125 M)室溫混勻5 min,冰上放置15 min。

2.細胞裂解

a.固定好的細胞340-600 g、4℃離心8 min,棄上清;

b.1 ml cold PBS重懸沉淀,340-600g 4℃ 離心8 min;

c.用1.25 ml cold lysis buffer(50 ml lysis buffer 加一片羅氏蛋白酶抑制劑)重懸沉淀,冰上靜止30 min(5min混勻一次);

d.600 g 、4℃ 離心5 min沉淀細胞核,核可用液氮凍存運輸。


以上,便是Hi-C常規樣本的制備細節,望對有意向或有計劃準備樣本的老師同學們有所幫助。對送樣樣本的嚴格把關,是推進項目的第一步。如對制備樣本上或非常規樣本的制備有疑問,可點擊下方按鈕聯系我們,我們將給您提出更佳的建議。

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