定量蛋白質組學研究方法介紹

2018年可謂是蛋白質組學發展歷程上非常重要的一年,以北京蛋白質組研究中心秦鈞教授課題組關于胃癌在蛋白質層面進行分子分型研究為代表,這篇文章主要就是利用定量蛋白質組學(label-free)方法對疾病進行分型分析,最終將彌漫性胃癌在蛋白水平分成了3種不同類型,這3種不同的分子亞型對預后和化療方案的敏感性是有差別的。

Fig.1?彌漫性胃癌腫瘤組織蛋白質組分型

我們看到,盡管都是胃癌,不同亞型的胃癌其實在蛋白的層面是不同的疾病,因此就會有不同的預后,除了癌癥等領域的分子分型和標志物篩選驗證以外,定量蛋白質組學在植物的生長發育、逆境脅迫、動物發育、感染性疾病等研究中也有廣泛的應用。

定量蛋白質組學(Quantitative Proteomics)是對一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜混合體系內所有蛋白質進行精確鑒定和定量。可用于篩選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達蛋白,結合生物信息學揭示細胞生理病理等功能,同時也可對某些關鍵蛋白進行定性和定量分析。

目前定量蛋白質組學應用比較廣泛的方法有非標定量(Label-free)和標記定量(iTRAQ)兩種。在這里我們給大家介紹一下這兩種定量蛋白質組學方法:

1、iTRAQ技術

iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術是由美國應用生物系統公司ABI研發的一種多肽體外標記技術。該技術采用4種或8種同位素的標簽,通過特異性標記多肽的氨基基團,而后進行串聯質譜分析,可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量。

技術原理:iTRAQ標記試劑由三部分組成,報告基團、質量平衡基團和肽反應部分,(1)報告基團:有八種,相對分子質量分別為113、114、115、116、117、118、119和121,因此iTRAQ最多可同時標記8組樣品;(2)平衡部分:相對分子質量分別為32、31、30、29、28、27、26和24,形成相對分子質量均為145的等量異位標簽,保證iTRAQ標記的同一肽段的質荷比相同;(3)肽反應部分:能與肽N端及賴氨酸側鏈發生共價連接而標記上肽段,幾乎可以標記所有蛋白質。?

?Fig.2?iTRAQ試劑結構
?Fig.3 iTRAQ實驗二級質譜圖

在質譜圖中,任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。在串聯質譜中,報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂,質量平衡基團丟失,帶不同同位素標簽的同一多肽產生質量為114,115,116和117Da(八標為113、114、115、116、117、118、119和121 Da)的報告離子(Fig.3中紅色標記),根據報告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。

iTRAQ實驗流程:

??Fig.4?iTRAQ實驗流程示意圖

由于iTRAQ技術上的限制,最多同時標記8個樣品,所以,當樣品數超過8個的時候就需要設置內參,以矯正不同批次之間的批次差異(搭橋技術)。比如:做14個樣品(來源于同一組織),則需要做成兩組8標的進行上機,每組7個樣品加1個內參(內參是多個樣品的混樣),總共需要做的樣品數就是7+7+1+1=16個。

TMT也是近年來應用比較廣泛的差異蛋白質組學技術,與iTRAQ一樣,TMT也是采用體外同位素標記的方法,利用同位素試劑標記蛋白質酶解后產生的多肽,對兩個或多個樣本在全蛋白質組層面上展開相對定量分析。二者區別只是不同廠家生產的標記試劑盒(iTRAQ是AB SCIEX研發,最多有8種標記試劑,TMT是Thermo Fisher研發,最多有10種標記試劑),在標簽分子結構上有些許差異,其他原理基本一樣。

iTRAQ技術特點:

(1)不同樣本標記之后混樣,統一處理上機,減少了分別上機造成的實驗誤差,并利用同位素標簽的豐度來檢測,定量更準確,重復性更好;

(2)由于需要標記試劑標記,因此成本相對較高;

(3)通量高,在一次實驗中最多可同時比較8個樣品;

(4)利用基于同一個參考樣品的辦法,可以進行多于8個樣品的定量比較;

(5)iTRAQ的覆蓋度高、靈敏度高。

2、Label-free技術

Label-free定量,即非標記的定量蛋白質組學,不需要對比較樣本做特定標記處理,只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質譜響應信號便可得到樣品間蛋白表達量的變化,通常用于分析大規模蛋白鑒定和定量時所產生的質譜數據。

Fig.5 Label-free實驗原理

Label-free實驗流程:?

Label-free技術特點:(1)不需要標記處理,操作簡單,成本低、實驗周期短;

(2)每個樣品單獨處理、上機;

(3)可以做任意樣本的總蛋白質差異定量,樣品類型不受限制;

(4)對單個樣品的蛋白總量要求相對較低,對于組織本身蛋白量不高,可以選擇label-free,適用于一些難收集樣品;

(5)定性沒有問題,但是定量的準確性較標記定量稍差,會受到質譜穩定性等因素的影響;

(6)適合于大樣本量的定量比較(大于24個樣本);

?好啦,今天對于定量蛋白質組學技術的介紹就到這里了,要做標記定量還是非標記定量,大家知道了嘛~~哈哈,其實選擇哪種方法是由具體的科研項目和前期的研究累計決定的,沒辦法說哪種技術方法更好,所以各位老師們不必糾結,只要能回答老師們感興趣的問題就是好方法!!對蛋白質組學感興趣的老師趕緊行動吧,掃描下方二維碼聯系我們~

 

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