高通量測序后的實驗驗證手段——轉錄組篇(上)

對于高通量技術大家一定都不陌生,但生物信息分析之后該做什么呢?本文和大家探討并分享高通量測序后的實驗驗證,即該用什么技術做什么驗證!

先和大家探討最常見的轉錄組測序后的驗證方法。轉錄組的驗證方法有點多(如表達量驗證、亞細胞定位、RNA結合蛋白、功能獲得驗證、功能缺失驗證等),本篇只先介紹表達量驗證、RNA結合蛋白、亞細胞定位,其余的下期見!

表達量驗證

一般情況我們優先選擇高表達量的RNA,以及差異表達明顯的RNA去驗證。去驗證某個基因或者RNA的表達量時,需要保證沒有基因組DNA的污染。PS:如果是非編碼RNA驗證,由于他們可能不含polyA尾巴,所以要注意反轉錄方式。

qRT-PCR

設計引物RNA進行qRT-PCR。

哈哈哈,如果你和小編一樣曾是生信dog,我相信你一定一臉懵逼,我連PCR到底是啥能干啥都不知道,你跟我說qRT-PCR!

小編以一個實驗編外人士跟你通俗易懂的科普一下,PCR是設計引物判斷某個DNA序列是否存在的技術;RT-PCR對RNA進行反轉錄(Reverse transcription)得到cDNA后,以cDNA為模板進行PCR反應,進而判斷某個RNA序列是否存在的技術;qPCR不只判斷DNA是否存在,還能判斷含量高低,qRT-PCR即quatitative RT-PCR,是判斷RNA是否存在以及含量高低的技術!

總結一句話,PCR都得設計引物,帶RT就是研究RNA,不帶RT就是研究DNA,帶q就是定量,不帶q就是定性!至于他是咋定量的呢,劃重點,靠內參!!

Northern blot

Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據其分子量大小加以區分,然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。PS:?Northern blot樣品需除去RNA酶。

小編再給大家科普一下下,Western Blot做蛋白,Southern Blot做DNA,Eastern blotting是Western Blot的變形也是作蛋白,不過沒得到廣泛認可。

靈敏度:qRT-PCR?>?Northern blot

特異性:Northern blot?>?qRT-PCR

RNA和蛋白互作驗證

RNA結合蛋白(RNA Binding Protein)是一類伴隨RNA的調控代謝過程,與RNA結合的蛋白質的總稱。RBP伴隨RNA生命始終,其主要作用是介導RNA的成熟、轉運、定位和翻譯;一個RBP可能存在多種靶標RNA;且其表達缺陷會造成多種疾病。RNA與蛋白相互作用是RNA功能研究的焦點問題之一。

RNA-pull down

已知RNA,尋找結合蛋白。

RNA pull-down實驗就是先將RNA進行標記(如生物素探針標記)再與蛋白共同孵育,從而形成RNA-蛋白質復合物,通過SDS-PAGE分離蛋白質,最后通過WB(western blot)或質譜(mass Spectrometry)檢測蛋白質。

該技術用于尋找與目的RNA結合的蛋白。

RIP

已知蛋白,尋找RNA。

RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉淀)技術采用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,經分離純化對RNA進行分析。

該技術用于尋找與目的蛋白結合的RNA。

EMSA

已知RNA,已知蛋白,判斷是否結合。

EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay,凝膠遷移)技術是通過凝膠電泳遷移檢測蛋白-RNA互作的一種技術。

首先將設計好的帶有標記的RNA探針與樣本蛋白混合孵育,形成蛋白-RNA復合物。因復合物分子量大,會在聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢,而沒有結合蛋白的探針則較快。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離,來確定RNA結合蛋白的特異性。

該技術用于體外驗證預測的RNA與蛋白之間是否能夠結合。

亞細胞定位研究

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位,例如在核內、胞質內或者細胞膜上存在。越來越多的證據顯示,在生物學過程中位于不同的亞細胞器RNA擁有不同的功能,亞細胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能。

RNAFISH

RNAFISH,即RNA的免疫熒光原位雜交,是將已標記的RNA探針(可在探針上標記熒光基團、生物素、地高辛等)與組織切片或細胞中的待測RNA中的互補序列雜交,從而對組織細胞中的RNA進行定性、定位和相對定量分析。

數據庫

偷偷的告訴你,RNALocate數據庫(http://www.rna-society.org/rnalocate)收錄了超過42,000個人工收集的RNA的亞細胞定位信息,包含超過23,100個RNA,在65個物種中的42個亞細胞定位。lncATLAS數據庫(http://lncatlas.crg.eu/)則是一個專門收錄lncRNA亞細胞定位的數據庫。有需要的可以先去查詢!

參考文獻:

Zhang T , Tan P , Wang L , et al. RNALocate: A resource for RNA subcellular localizations[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(Database issue).

Mas-Ponte D, Carlevaro-Fita J, Palumbo E, Pulido TH, Guigo R, Johnson R. LncATLAS database for subcellular localization of long noncoding RNAs. Rna. 2017 Jul 1;23(7):1080-7.

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