高通量測序后的實驗驗證手段——轉錄組篇(下)

上篇文章介紹了高通量測序后的實驗驗證手段,主要介紹了表達量驗證、RNA結合蛋白、亞細胞定位本文從功能方面來對轉錄組測序的結果進行驗證,功能方面無非就是使感興趣的基因的表達升高(功能獲得)或降低(功能缺失)看樣品表型是否有變化。基因過表達和基因沉默是研究基因功能的兩個重要手段。

功能獲得研究

功能獲得:過表達基因

構建克隆,將目的基因連接在特定的載體(可以是慢病毒載體、腺病毒載體、質粒)上,在載體上一般含有增強基因轉錄的promoter。將克隆導入表達細胞中,即轉化或轉染(如果是昆蟲表達系統,構建的質粒還需要先轉座成為桿狀病毒基因組才能用于轉染)。轉染進入細胞內的外源基因在其上游強啟動子的作用下可以直接過量表達。

功能缺失研究

功能缺失:敲除、敲減、沉默基因表達

常用的沉默基因表達方法有,RNA干擾、CCRISPR/Cas9、反義寡核苷酸、位點反轉和啟動子缺失等方法。可根據感興趣RNA的亞細胞定位選擇合適的敲減方法,如RNA干擾作用只作用在胞漿(胞漿+細胞器=胞質)內,無法對細胞核起作用,此時siRNA或者shRNA方法可能不適用,需要用其他方式進行基因沉默。

反義寡核苷酸

反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)是指進行了某些化學修飾的短鏈核酸(約15-25個核苷酸組成),其堿基順序排列與特定的靶標RNA序列互補,進入細胞后可按照Watson-Crick堿基互補配對的原則與靶標序列形成雙鏈結構。反義寡核苷酸與靶標RNA結合后可抑制靶標RNA的表達。

RNAi

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指,將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA,與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA)導入細胞,可以使mRNA發生特異性的降解,導致其相應的基因沉默的現象。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNAi。

RNAi的實現有兩種方式,一種是直接購買siRNA寡核苷酸片段,轉染到靶細胞中;另一種是利用shRNA慢病毒載體構建穩轉的細胞系,shRNA在細胞中被加工為siRNA,進而發揮RNAi的作用。

CRISPR/Cas9

CCRISPR/Cas9是一種由RNA指導的,利用Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術。該技術可方便快捷對任意基因進行編輯改造,比如基因敲除,敲入,定點突變等,不過卻有相當的脫靶概率

從哪些方面可以看到基因表達的變化對表型造成變化呢,一般都是由淺入深,由細胞模型到動物模型!有了這種全方位驗證,想發低分文章都不能夠!

細胞實驗

通過改變該基因在細胞內的表達,來探討細胞表型是否會發生改變。如細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、遷移侵襲、細胞粘度、耐藥,還有難一點的血管形成、能量代謝等。

細胞表型的改變通常進行正反兩種實驗,如敲除某基因驗證細胞凋亡時,做TUNEL實驗驗證其凋亡后,還需Rescue實驗將敲除基因重新導入細胞看是否能挽救表型。

細胞增殖

CCK-8/CFSE流式法、克隆形成實驗、MTT檢測細胞增殖

細胞凋亡

流式細胞術、Tunel法、Annexin V/PI雙染法,以及細胞凋亡形態學檢測(光學顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察細胞形態學改變,熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細胞核染色質的形態學改變)

細胞遷移和侵襲

Transwell

如果用matrigel膠包被transwell小室可以檢測腫瘤細胞的侵襲能力(invasion);反之,不包被transwell小室檢測腫瘤細胞的遷移能力(migration)。

是不是看不懂,沒事,多看看文獻,做的時候自然就懂啦……

 

動物實驗

通過改變關注基因在動物內的表達,來探討動物的表型是否會發生改變。因此,構建模擬人類疾病表型的動物模型至關重要。

醫學動物模型

  • 誘發性動物疾病模型

    人為地誘發動物產生類似人類疾病模型

  • 自發性動物模型

    不加任何人工誘發,自然條件下自然產生疾病的動物。

  • 疾病型動物模型

    即特定的疾病不會在某種動物發生,可研究天然抗性的因素。

  • 生物醫學動物模型

    動物正常的生物學特征來提供人類疾病相似表型的疾病模型。

常見腫瘤模型

  • 自發瘤模型

    未經任何有意識的人工處理,自然形成腫瘤

  • 誘發瘤模型

    利用外源性致癌物引起細胞遺傳特性改變,從而出現異常生長活性細胞,形成腫瘤。常用實驗動物為大鼠,也有用小鼠、豚鼠、兔、犬等。

  • 移植瘤模型

    將動物或人體腫瘤細胞/組織移植到動物體內連續傳代而形成腫瘤。腫瘤研究中最常用的是裸鼠模型,即建立皮下移植瘤模型(將腫瘤細胞或腫瘤組織直接種植在小鼠的皮下)。

    注:不易成瘤的腫瘤組織一般選擇腫瘤腎被膜下種植移植瘤模型

  • 基因組修飾模型

    通過在動物整體敲除或插入特性的基因而建立的腫瘤模型。

采用所研究的疾病/性狀對應的動物模型,對動物模型采用上述技術對特定基因進行過表達或沉默處理,接下來去檢測相應的指標。如采用NB技術檢測相應基因的表達、腫瘤相應的生長曲線、HE檢測組織的形態變化等。

 

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