《NC》cd8+t細胞:新LncRNA的表達可鑒定病毒特異的效應及記憶CD8+T細胞

英文標題:Expression of novel long noncoding RNAs defines virus-specific effector and memory CD8+ T cells

發表雜志:Nature Communications

影響因子:12.353

發表時間:2019年1月

研究背景

病毒感染后,CD8 +?T細胞擴增并分化成不同類型的效應細胞,抗原遷移至炎癥部位殺死抗原表達細胞。 清除病毒后,大多數抗原特異性CD8+T細胞會死亡,但一小部分長壽命的記憶細胞仍然存在。綜合性研究已經確定了與該過程相關的蛋白編碼基因轉錄水平的變化。在效應時期,細胞可表達與增殖、遷移和細胞毒性相關的基因。病毒清除后,多數基因表達恢復初始狀態,但許多關鍵轉錄因子(Tbx21,Prdm1)、遷移因子(Cd44, Cxcr3)和細胞因子受體(Il12rb, Il18ra)的水平仍處于高水平以確保可快速恢復效應狀態。

更重要的是,小鼠和人在效應及記憶T細胞分化中已觀察到一些相似的基因程序。這些研究集中于編碼轉錄本的水平,但目前關于非編碼轉錄本在這一過程中的表達變化鮮有報道。作者基于之前工作采用RNA-seq展開研究,以鑒定響應病毒感染的人和小鼠CD8 +?T細胞中長非編碼RNA(lncRNA)表達的變化。通過lncRNA測序研究,鑒定出上百條未注釋的lncRNA,基于表達分析可以將lncRNA對初始、效應和記憶CD8+T細胞亞群分類,意味著在抗原啟動分化過程中它們可能參與決定不同分化命運。通過小鼠與人類lncRNA表達數據的比較,發現具有保守性的lncRNA。

材料和方法

●?LCMV感染及細胞分選: LCMV病毒感染小鼠,分選不同類型的細胞進行后續RNA測序。

●?LncRNA測序研究:基于RNA-seq進行lncRNA表達分析。5組類型細胞,包括native、終末分化效應T細胞(short-livedterminal effector ,TE)、記憶前體T細胞(memory precursor ,MP)、中心記憶T細胞(central memory ,CM) 、效應記憶T細胞(effector memory ,EM),每組3個重復。

●?生信分析:轉錄本組裝、表達分析、同源性分析。

●?RACE驗證。

研究結果

1、通過小鼠CD8+T細胞測序數據,基于轉錄組組裝發現未注釋基因,以及T細胞分化過程中lncRNA的動態變化。

從LCMV感染小鼠中分離病毒特異性的CD8+T細胞亞群,對不同類型的細胞進行RNA-seq。包括初始T細胞、終末分化效應T細胞(short-livedterminal effector ,TE)、記憶前體T細胞(memory precursor ,MP)、中心記憶T細胞(central memory ,CM) 、效應記憶T細胞(effector memory ,EM)。基于數據組裝分析,共鑒定到13909個unique genes,75%是蛋白編碼基因,25%是非編碼。在非編碼基因中,三分之一在數據庫中未收錄,因為認為是新基因。這些新基因比已注釋非編碼基因有較高的表達水平,但這兩類基因均比編碼基因低表達。采用CPAT進行編碼潛能分析,大部分新轉錄本包括單個外顯子,不到25%的新轉錄本包括2個及以上外顯子。雖然不具有蛋白編碼潛能,但大部分新基因在CD8+T細胞分化過程中表現出特異性,包括記憶細胞中的特異性表達。

在13909基因中,與初始細胞相比,有5266個至少在一個細胞亞型中差異表達。感染過程中,884個lncRNA差異表達,其中有525個未注釋。在感染8天后的TE和MP細胞之間有181個差異非編碼基因,其中123個未注釋。48天后,378個非編碼(230新基因)與初始相比顯著差異表達,但在CM和EM細胞相比,167個差異基因表達,29個為非編碼(20個新的)。

2、lncRNA表達分析分類CD8+T細胞亞群。

由于在CD8+T細胞分化過程中表現出來的差異表達,進一步通過PCA分析是否可以對不同亞群細胞分類。結果表明編碼基因、非編碼和新基因均可以分類。其中組裝得到的新基因分類結果與編碼基因分類結果一致,說明這些新基因對T細胞的分化及功能的重要性。為進一步鑒定特異性lncRNA,篩選具有類似表達模式的差異基因。鑒定出14個差異表達的cluster,其中非編碼與編碼并未表現出cluster分離,表明二者有相似的表達過程。比如一些非編碼基因在CD8+T細胞激活后表達上調或下調,在記憶期維持效應水平,與編碼基因Cd44和Cd200類似。第8天的MP和TE細胞相比,差異lncRNA存在于一些cluster中(clusters 4, 8, and 13 ),表明lncRNA可能涉及T細胞早期分化命運。

3、人抗原特異性CD8+T細胞中lncRNA的表達分析。

基于之前健康志愿者的測序數據(采用YFV-17D黃熱疫苗,分選CD8+T細胞,收集初始T細胞,14天CD8+T細胞、28天CD8+T細胞、記憶細胞),進行轉錄組分析。鑒定出已注釋的3165個非編碼轉錄本,1098個未注釋的。與小鼠數據相比,人數據中也表現出編碼基因表達高于非編碼基因。同樣許多鑒定的新轉錄本是單外顯子,編碼潛能低于鼠鑒定的轉錄本。與小鼠數據類似,許多新轉錄本在T細胞分化中表現出特異性。

基于差異分析,4099個基因至少在一個分化時期顯著變化,838個是非編碼基因。28.3%的編碼基因在感染過程中顯著變化。非編碼基因中,相比已知lncRNA,28.3%新lncRNA在感染后顯著差異表達,已知lncRNA占比16.7%。接下來同樣進行PCA分析lncRNA在分化過程中的作用。與小鼠數據相似,基于編碼基因、非編碼基因及新基因將T細胞分為3類:初始、效應及記憶細胞。非編碼基因的分類結果與編碼基因結果類似。基于聚類分析,有11個表達的cluster。與小鼠數據類似,編碼基因與非編碼基因并未表現出cluster分離。并且有一些時期特應性的cluster,比如cluster3在激活后上調且在病毒清除后保持該水平,cluster2則恢復到初始狀態,cluster1則接近于初始水平。許多下調基因在記憶形成后恢復到初始水平(cluster11),但有些基因比初始狀態更低(cluster10)。結合小鼠測序數據,結果表明非編碼基因在多種哺乳動物CD8+T細胞分化中發揮重要作用。

4、CD8+T細胞中lncRNA表達的保守性。

由于lncRNA在小鼠與人數據表現出的生物學過程相似性,將兩者轉錄本序列進行比對。僅有一部分小鼠lncRNA包含人轉錄本同源序列,當然也會存在比對到人編碼基因及假基因上的序列。許多同源lncRNA在對比物種上有多個同源基因座。除了序列保守,共線性(位置保守)也是考慮因素。因此接下來分析T細胞分化過程中保守性的lncRNA。通過比較二者效應和記憶期基因的差異倍數,但在任一個階段未發現保守且表達顯著相關的基因。但這些保守性基因在這2個時期表現出中度相關(r = 0.36 and 0.46, p = 0.0007 and 0.0008, respectively)。

小結

文章基于RNA測序對小鼠T細胞不同階段的基因表達進行綜合比較,鑒定出不同階段特異表達的基因,包括已知和新的lncRNA,其可能參與作用于細胞分化過程。此外,通過與人的測序數據相比較,具有序列保守的lncRNA在二者間的表達類似,表明在CD8+T細胞分化過程中的進化保守性。

參考文獻

Hudson WH, Prokhnevska N, et al.?Expression of novel long noncoding RNAs defines?virus-specific effector and memory CD8+?T cells. Nature Communications, 2019.

 

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