三代重測序助力阿爾茲海默癥研究

2019年3月在Acta Neuropathologica雜志(IF=15.87)發表了一篇Loss of DPP6 in neurodegenerative dementia: a genetic player in the dysfunction of neuronal excitability 文章。簡單一句話介紹就是,作者采用二代和三代Nanopore重測序數據找到了DPP6上的4M大小的倒位,并采用二代測序數據大隊列研究DPP6基因的變異對阿爾茲海默癥的影響。

摘要

新出現的證據表明,神經退行性腦疾病(NBD)中存在一種匯聚機制,早期神經網絡功能障礙和神經穩態的改變,這些都是神經退行性疾病的罪魁禍首。本研究中,作者采用二代測序和三代長read全基因組測序來研究常染色體顯性遺傳史的癡呆家族顯著關聯的7q36。他們識別并驗證了4Mb的倒位在疾病單倍型中分離,并擾亂了DPP6基因的編碼序列。在早發性阿爾茲海默癥和額顳葉癡呆中,利用DPP6基因的重測序技術識別了更多罕見的非同義突變,移碼突變和無義突變。

DPP6是一個II型跨膜蛋白,有著高度結構的細胞外的結構域,并且主要在腦中表達。DPP6與鉀通道Kv4.2形成多聚體復合物,調節腦中電壓依賴性門控特性。Kv4.2在大腦中的表達在神經元興奮性中起關鍵作用。體外模擬發現患者的無義突變會改變DPP6,并降低薄膜表達進而導致蛋白的缺失。在無義突變攜帶者上可以檢測到DPP6和Kv4.2表達降低。同時DPP6的缺失會導致神經過度興奮,敲除Dpp6的小鼠的行為會發生改變。總而言之,DPP6作為癡呆研究中的新基因,能夠加強神經過度興奮,并能改變神經細胞啟動的內穩態。

測序方法

二代重測序:4個1270患病家族中第三代的子女;

三代重測序:上述4個樣品中的patient III-48以及10名無關癡呆患者和對照組樣品,采用牛津納米孔公司(Oxford?Nanopore?Technologies,簡稱ONT)的高通量測序平臺PromethION測序儀進行長read基因組測序,首先用Megaruptor 將DNA被打斷成35Kb,并采用BluePippin 選擇最短6kb的片段進行文庫制備和測序;

DPP6基因重測序:對558個早發性阿爾茲海默癥患者(EOAD,平均發病年齡61.6±6.8)和614個額顳葉癡呆患者(FTD,平均發病年齡66.1±9.9),采用Illumina公司 Miseq測序儀對DPP6基因完整的編碼區域重測序。

分析結果

1270家族的二代測序結果

先前對1270家族的7q36的遺傳分析識別了五個不同基因(ABCF2, GALNT11, DPP6, PAXIP1, EN2 )的七個變異,且在1270家族的疾病單倍型中是分離的。大多數這些變異是同義突變,并且只有PAXIP1 p.A660變異在對照個體中是缺失的。目前公開的基因數據(如ExAc)顯示,PAXIP1存在不同的核苷酸變化,導致同樣的沉默突變(p.A660),這使得PAXIP1不太可能具有有害影響。此外,我們沒有發現PAXIP1在患者淋巴母細胞中異常剪接的證據。

對1270家族的第三代4個患病的兄弟姐妹(III-12,III-38,III-41,III-48)進行WGS測序。選擇4個患者共有的注釋的高質量的遺傳變異,罕見的(千人基因組計劃中<1%)或者雜合的非編碼變異進行后續研究。在STR標記D7S636和D7S559上連鎖區域的位點保留了79個非編碼的變異。驗證和分離分析保留了38個非編碼變異,這些變異在1270家族的疾病單倍型中共分離。對照個體中的變異的基因型顯示4個變異對于1270家族是唯一的。其中3個變異均位于DPP6基因的1號內含子上,另一個變異位于基因間區(距SHH基因最近,27.3Kb)距離DPP6基因下游908kb。而這四個變異在ENCODE注釋都不具有潛在的高度破壞性。

注:共分離是指在有性繁殖的后代,假如基因附近有一緊密連鎖的分子標記,在細胞減數分裂時分子標記與基因之間由于相距太近很少有機會發生交換,那么這種分子標記與連鎖的基因有最大的可能同時出現在同一個個體中。

為了排除是連鎖區域外的編碼變異引起的疾病,作者提取了WGS數據的外顯子,并且分析了罕見的及新的編碼非同義變異。選擇四個患者共有的雜合變異(UTRs,同義和非同義)。只驗證了出現在已知的蛋白編碼基因的罕見或者新的變異。這個選擇產生了9個非同義突變,如下表,但卻在1270家族中沒有與疾病共分離。

連鎖7q36區域存在4Mb的反轉破壞了DPP6序列

作者設計引物擴增連鎖區域去證實這些變異,結果發現PCR產物在兩個7號染色體的位點比對到了相反的方向,且距離將近4Mb。7號染色體上的局部比對,證實了反向雜合低拷貝重復的出現。遠端的斷點位于7q36.2連鎖區域上,DPP6基因的1號內含子上,被預測改變了基因的編碼序列;臨近的倒位斷點位于連鎖區域之外。

作者對III-48號樣品進行三代測序去驗證前面推測的結果。作者采用PromethION測序對III-48號患者進行測序,約6X覆蓋度,得到21.2G數據。在七號染色體的149,704,610–153,786,893區域發現了倒位。而這個7q36.2倒位(在DPP6基因的1號內含子上存在斷點),卻沒有在先前的209個無關個體的二代WGS數據中被發現。同時用三代ONT平臺產生的10個癡呆患者和對照患者也都沒有出現這個倒位。

DPP6上的罕見變異與神經退行性癡呆相關

為了更好的理解DPP6對于退行性癡呆(NBD)的遺傳貢獻,作者對558個早發性阿爾茲海默癥(EOAD)和614個額顳葉癡呆患者(FTD)的DPP6編碼外顯子進行測序并識別罕見的蛋白改變的變異。在2個FTD患者中識別到兩個終止密碼子突變(PTC),p.E79Gfs*9 和p.Q23O* ,且在755個對照組中是缺失的。此外,在阿爾茲海默癥(AD),FTD及對照組的1號外顯子上識別到了22個錯義變異以及大小變化的Gly插入/缺失。最后發現DPP6基因上罕見變異與AD、FTD顯著的關聯。

罕見變異改變患者腦組織中DPP6表達水平

只有3個攜帶DPP6無義突變的患者的解剖大腦被凍存。這三個患者的神經病理學診斷分別是阿爾茲海默癥AD,FTLD-TDP typeD(FTD行為變異和佩吉特氏骨病),FTLD-ALS type B(FTD行為變異及球類型)。結果發現三個DPP6變異(p.P509R, p.R47L, and p.D596N)?的mRNA表達水平顯著下調,并且發現p.P509R和p.R47L 攜帶者的DPP6蛋白表達水平也顯著下降。

參考文獻

Loss of DPP6, in neurodegenerative dementia: a genetic player in the dysfunction of neuronal excitability[J]. Acta Neuropathologica:1-18.

 

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