RRBS測序輔助同卵雙胞胎EWAS-BMI關聯研究及肥胖表觀遺傳機制研究【成功案例】

2019年5月,青島大學醫學院學者發表了有關同卵雙胞胎肥胖表觀調控的研究,該研究中簡化甲基化測序由百邁客生物科技有限公司完成,詳情如下。

英文題目:DNA methylome profiling in identical twin pairs discordant for body mass index

發表雜志:International Journal of Obesity

影響因子:5.151

合作單位:青島大學醫學院

【研究背景】

糖尿病和心血管疾病是發達國家和發展中國家的常見病癥,對生活質量和死亡率有很大影響。這些病癥通常與肥胖有關,其體重指數(BMI)是一個重要的衡量指標。以體重除以身高的平方來計算的體重指數(BMI,kg/m2)是體重和肥胖的簡單指標。BMI已經被廣泛使用,傳統的流行病學研究揭示其與環境因素的關聯,包括職業、收入和許多其他因素。重要的是,雙胞胎研究高遺傳率預計高達90%,表明遺傳因素對BMI變異的貢獻很大。

在過去的十年中,全基因組關聯研究(GWAS)發現了常見的遺傳多態性與復雜疾病和健康特征(包括BMI)相關的罕見遺傳變異。但是,與預估的高遺傳率(40-70%)相比,報道的遺傳多態性僅解釋了有限比例的BMI變異(2-21%)。已經使用DNA甲基化分析進行了大規模表觀基因組關聯研究(EWAS),但是僅報道了少數顯著的基因組位點。有限的發現可能是由于部分控制不良的混雜因素,包括遺傳和環境因素。由于同卵雙胞胎(MZ)共享基因組成,MZ雙胞胎對于疾病或性狀不一致,可作為高度遺傳性疾病或表型EWAS研究的理想樣本。作者基于計算機模擬研究表明,EWAS中不一致的雙胞胎研究具有高度豐富的統計檢力,特別是對具有高遺傳基礎的疾病。作者采用RRBS(簡化甲基化)測序對30對BMI不同的同卵雙胞胎進行了EWAS研究,討論了肥胖潛在病因。

【研究方法】

  • 樣本選擇:30對同卵雙胞胎,包括15對男性和15對女性,無藥物治療,無診斷疾病(如癌癥,心血管疾病,2型糖尿病,精神疾病等),年齡39-72,BMI18.9-37.7。收集全血樣本。
  • 測序技術:簡化甲基化測序(RRBS)。
  • 驗證:Mid-aged Danish Twin (MADT) cohort ?229對樣本表達數據進行基因驗證。

【研究結果】

1、樣本情況

表1展示了樣本相關人體測量和生化變量的結果。最后一列是每個變量的對內相關性。大多數變量具有相當高的和/或顯著相關性,一些顯示低或不顯著的對內相關性(例如GLU,TG)。下圖顯示了每對雙胞胎的BMI測量值。所有雙胞胎都與對角線保持距離,表明BMI測量中的對內不一致。同時,圖中的總體模式還表明如表1中報告的BMI的弱配對內相關性(r = 0.307,p = 0.099)。在男性(實點)和女性(空點)雙胞胎中沒有觀察到BMI不一致的性別特異性模式。

2、單個位點EWAS關聯分析

基于單個位點的EWAS分析,鑒定出136個CpG(p <1e-04),其中30個CpG(p <1e-05),2個CpG(p <1e-06)。 沒有位點達到全基因組顯著性(定義為FDR <0.05),最低FDR = 0.195。 圖中顯示了每個CpG位點的p值與其染色體位置的曼哈頓圖(圖a)和針對隨機預期p值分布繪制的預估p值的Q-Q圖(圖b)。最顯著CpG?p值表明與隨機分布的偏差及其陰影區域的95%置信區間(圖b),說明這些CpG與BMI的非隨機關聯。

3、生物學通路分析

采用biomaRt,38487個CpG中(P<0.05),23,863個CpG注釋到2542個功能基因,基于GSEA在BioCarta 基因集, KEGG 基因集和Reactome基因集富集分析。富集通路相關基因包括參與編碼細胞外基質(ECM)相關蛋白,包括ECM糖蛋白、膠原蛋白和蛋白多糖;以及參與神經元系統和發育生物學的基因。富集結果也涉及神經元功能通路,涉及參與化學突觸傳遞,軸突導向和NGF信號傳導(神經生長因子)的基因。38,487(p < 0.05)個CpGs采用GREAT分析其富集的調控區域。結果表明15個具有統計學意義(p < 1.072e-10)的生物學功能聚類,涉及膠質細胞再生正負調節(FE:2.49, FE:2.03)、脂質合成負調節( FE:2.61)、甲狀腺發育 (FE:2.83)、視網膜桿細胞發育(FE: 3.54)等。

4、基因組區域注釋及利用MADT表達數據驗證

采用comb-p矯正p,鑒定出11個FDR<0.1的DMR,其中9個FDR<0.05,位于染色體1、2、3、5、6、9、10和18 。4個有意義的 DMRs (從chr 1:1103393-1103564,chr 1:990300-990641;chr 6:1594287-1594438;?chr 10:102026134-102026689 )包含了有顯著意義的CpGs 。4個DMR位于基因間區,其余7個注釋在9號染色體LINC01503(RNA基因)、5號染色體DPYSL3(與非酒精性脂肪肝相關), 1號染色體CHD5和AGRN(有研究孕婦體重指數對新生兒血液DNA甲基化的影響), 2號染色體C1QL2, 10號染色體CWF19L1, 及6號染色體 AKAP12。圖中展示了11個DMR的甲基化模式,除了圖f和j的DMR與BMI呈負相關外,其余9個DMR與BMI呈正相關。采用Danish雙胞胎的基因表達數據,檢驗了與11個DMR相關的7個基因表達水平與BMI的相關性。LINC01503和AKAP12有顯著意義。

【小結】

雖然單CpG位點EWAS沒有鑒定出顯著性位點,但是功能富集分析結果表明了一些有意義的基因。比如由于BMI不一致引起的DNA甲基化改變可能與發育相關,可能涉及早期事件如低出生體重。10條富集的通路都與細胞外基質(ECM)有關,在細胞外基質中,脂肪組織中的過量沉積會惡化胰島素敏感性。DMR相關基因也有報道與肝臟脂肪沉積相關。未有顯著性位點結果與樣本量較少及BMI高遺傳判斷也有關系。同時研究結果也表明,基于BMI不一致的雙胞胎樣本研究表觀遺傳學,可能會高度重視早期生活事件對成年BMI的表觀遺傳學影響,需謹慎將調查結果推廣到非雙胞胎人群。

參考文獻

Li W, Zhang D ,Wang W, et al. DNA methylome profiling in identical twin pairs discordant for body mass index. International Journal of Obesity, 2019.

 

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