全長轉錄組測序

?產品介紹

全長轉錄組研究是理解生物機體功能的一個重要途徑。傳統二代轉錄組測序無法直接獲得單個RNA分子由5ˊ到3ˊ的全部序列。基于PacBio三代測序平臺的轉錄組研究,無需打斷,直接讀取反轉錄的全長cDNA,能夠有效的獲取高質量的單個RNA分子的全部序列,準確辨別二代測序無法識別的同源異構體(isoform)、同源基因、超家族基因或等位基因表達的轉錄本。

分析內容

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結果展示

測序reads展示

全長轉錄組采用單分子實時測序技術,通過構建啞鈴型文庫,以環形方式循環測序。為了避免測序過程中對短片段偏好性,保證不同長度轉錄本的覆蓋度,會按照轉錄本長度分開建庫。通過對各文庫測序所得reads長度統計,評估各文庫構建質量。

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ROI 序列長度分布

下機原始數據通過數據處理去除啞鈴型接頭部分,每個單分子ZMW里插入序列的最高質量序列即為ROI序列,ROI數量是評估測序好壞的一個指標。ROI序列長度與建庫時的cDNA長度選擇有關,ROI序列隨cDNA長度的增加而增加。

可變剪接分析

基因轉錄生成的前體mRNA(pre-mRNA),有多種剪接方式,選擇不同的外顯子,產生不同的成熟mRNA,從而翻譯為不同的蛋白質,構成生物性狀的多樣性。這種轉錄后的mRNA加工過程稱為可變剪接或選擇性剪接(Alternative splicing)。可變剪接類型包括:(A) 外顯子跳躍;(B) 可變轉錄終止位點;(C) 可變外顯子;(D) 可變轉錄起始位點;(E) 內含子保留。百邁客使用Astalavista軟件獲取每個樣品存在的可變剪接類型。

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轉錄本NR注釋

Nr數據庫是NCBI中的非冗余蛋白質數據庫,包含了Swissprot、PIR(Protein Information Resource)、PRF(Protein Research Foundation)、PDB(Protein Data Bank)蛋白質數據庫及從GenBank和RefSeq的CDS數據翻譯過來的蛋白質數據信息。通過序列比對尋找同源物種,并進行注釋。

轉錄本GO注釋

GO數據庫是GO組織(Gene Ontology Consortium)于2000年構建的一個結構化的標準生物學注釋系統,旨在建立基因及其產物知識的標準詞匯體系,適用于各個物種。GO注釋系統是一個有向無環圖,包含三個主要分支,即:生物學過程(Biological Process),分子功能(Molecular Function)和細胞組分(Cellular Component)。

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轉錄本KEGG注釋

在生物體內,不同的基因產物相互協調來行使生物學功能,對表達基因的通路(Pathway)注釋分析有助于進一步解讀基因的功能。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系統分析基因功能、基因組信息數據庫,它有助于研究者把基因及表達信息作為一個整體網絡進行研究。

全長轉錄組測序中,為什么要建3個以上文庫?

答:全長轉錄組采用單分子實時測序技術,通過構建啞鈴型文庫,以環形方式循環測序。測序時,短片段文庫更容易落入零模波導孔。為了避免測序過程中短片段文庫偏好性,保證不同長度轉錄本的覆蓋度,因此,會構建3個或3個以上文庫。

全長轉錄組中ROI,subread, FLNC分別指什么?

答:ROI(Reads of Insert):指每個單分子測序反應器ZMW里插入序列的最高質量序列

Subread:每個聚合酶序列(polymerase read)被分割成的一個或多個子序列(Subread)

FLNC(Full-Length non-chimericRead):全長非嵌合序列,即兩端同時含有3’引物和5’引物,及3’引物前含有polyA尾的非人工嵌合序列。

建庫過程中因接頭濃度或SMRTbell濃度過低造成兩個cDNA模板鏈直接相連而生成的嵌合序列稱為人工嵌合序列

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